分子试验思路及方法

1、一、 整体试验思路：二、 具体实验方法：（一） RNA提取方法：Unizol 法：1 0.1g样品加1ml 提取缓冲液（Unizol），摇晃，放到冰里。2 匀浆：匀浆器用之前要先用DEPC水清洗，再用无水乙醇清洗。3 分别取匀浆液到新管中，盖好，做好标记。12000g 28 离心10min。4 取上清液到另一个离心管中，室温静置5min。5 按每ml提取液加入200ul氯仿（三氯甲烷）。剧烈震荡15秒，室温静置2-5min.6 12000g 28 离心15min。7 取上清，按每ml提取液加入500ul异丙醇，混匀。-20 静置2h。8 12000g 28 离心10min。9 去掉上清，加入7

2、5%酒精 1ml（该酒精要用DEPC水稀释），7000g 离心 7min。10 去掉上清，干燥。11 加入20ul或30ul DEPC水溶解。12 取5ul电泳检测，1ul测定浓度及纯度，其余的-80度冰箱保存或直接反转录。Aidlab RNA提取试剂盒：（快速、效果好些）1 匀浆：组织<20mg 加350ul，组织2030mg 加600ul 裂解液RLTplus，电动匀浆2040秒。2 将匀浆后裂解物13000rpm 离心3min，将上清液全部加到DNA清除柱上。3 立刻13000rpm离心60秒，保留过滤液。（确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留）4 用移液枪精确估计滤液体积，加入

3、一般体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。5 立即将混合物（每次小于700ul，多余的可分为两次）加入一个吸附柱RA中，13000rpm 离心30秒，弃掉废液。6 加700ul 去蛋白液 RW1，室温放置1min，12000rpm 离心30秒，弃掉废液。7 加500ul 漂洗液RW，12000rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500ul漂洗液RW重复一遍。8 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm 离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。9 取出吸附柱RA，放入一个RNase free 离心管中，在吸附膜的中间部位加3050u

4、l RNase free water，室温放置1min，12000rpm 离心1min。10 若想使RNA浓度高，可将第一次的洗脱液加回柱子，重复一遍。（二） 反转录：Takara 公司反转录试剂盒：5×PrimeScript Buffer 2ulPrimeScript RT Enzyme Mix1 0.5ulOligo dT Primer 0.5ulRandom 6 mers 0.5ulTotal RNA 按说明书要求浓度添加RNase Free dH2O 加水补齐至总体积为10ul（注：可成倍扩大体系）反应条件：37 15min85 5 sec（三） PCRPCR反应体系：H2O

5、 11.6uldNTP mixture 3.2ulPCR buffer 2ulcDNA 1ul正向引物 1ul反向引物 1ulTaq 酶 0.2ul 共：20ulPCR反应条件：1 94 4min2 94 30sec3 52 45sec （该步退火温度可变）4 72 1min5 Go to 2 cycles 296 72 10min7 4 forever（四）实时荧光定量PCR：Takara 公司 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒：内参基因：一般为-actin。目的基因与内参基因各做3个平行。引物设计要求：PCR扩增产物长度：80150bp最为合适（可延长至300bp）引物长度：1

6、725 mersGC含量：4060% （4555%最佳）Tm值：正反向引物Tm值不能相差太大 OLIGO：6368 Primer 3：6065引物序列： A、G、C、T整体分布尽量均匀。不要有部分的GC rich 或AT rich（特别是3端）。尽量避开T/C 或A/G的连续结构。3末端序列：避免GC rich 或AT rich。3端碱基最好为G或C。尽量避免3末端碱基为T 。互补序列：避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。两条引物间的3末端避开有2个以上的互补序列。反应体系：SYBR Premix Ex Taq (2×) 10ulPCR正向引物(10uM) 0.4ul

7、PCR反向引物(10uM) 0.4ulcDNA模板 2uldH2O 7.2ul 共20ul程序：1 95 30s2 94 15s3 58 20s4 72 20s + Plate read5 Go to 2 ， 39 more times6 Melt curve 60.0 to95.0, increment 0.5 for 0.05s + plate read7. End（五）基因全长的扩增：引物设计要求：1. 引物长度 2328nt2. GC含量： 5070%3. Tm值>=65,最好是>704. 3端不要跟试剂盒中的UPM引物互补5. 与目的基因互补配对Race cDNA 的反转

8、录：采用Clontech 的SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒 （Takara 公司就可以买到）所有都在冰上加样，加完震荡混匀，再用mini-Spin 收集，最后加酶。1 3-race及5-race均做以下mix，每10ul cDNA 合成反应加：5×First-Strand Buffer 2ulDTT (20mM) 1uldNTP Mix (10mM) 1ulTotal 4ul2. 5-RACE 3-RACERNA 12.75ul (10ng1ug) RNA 13.75ul5-CDS Primer A 1ul 3-CDS Primer A

9、 1ulSterile H2O 补齐 Sterile H2O 补齐Total 3.75ul Total 4.75ul3. 混好，收集，72 3min， 42 2min。4 冷却后 14000g 离心10s，收集到底部。5 5-RACE 加1ul SMARTer A oligo 每个反应。6 以上4.75ul 3及5-RACE cDNA 加以下试剂： 第一步混好的 Buffer mix 4ul RNase Inhibitor (40U/ul) 0.25ul SMARTScribe Reverse Transcriptase (100U) 1ul 共：10ul。7 轻轻地用移液枪混匀，收集到管底。

10、8 42 90min， 70 10min。9 用Tricine-EDTA Buffer 稀释：总RNA <=200ng，加20ul总RNA >=200ng，加100ul10 cDNA 在-20 可保存3个月。RACE PCR 反应体系：（采用Takara 公司的 Ex HotStar 酶）ddH2O 15.37ul10×Ex HotStar Buffer 2.5ul10×UPM 2.5uldNTP (2.5mM) 2ulcDNA 2ul引物 （10uM） 0.5ulEx HotStar Taq 酶 0.13ul 共：25ulRACE PCR 反应程序：1 如果引物Tm值>70，最好用下面的Touch down 程序（特异性高）Touch down 程序：5 cycles： 94 30