中药熏蒸治疗大鼠佐剂性关节炎的疗效及抗炎机

1、中药熏蒸治疗大鼠佐剂性关节炎的疗效及抗炎机中药熏蒸治疗大鼠佐剂性关节炎的疗效及抗炎机沈鹰，陆继娣目的：观察中药熏I方熏蒸对大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)的疗效，并探讨其抗炎机制。方法：雄性Wistar大鼠50只，随机分为正常组、模型组、蒸馏水熏蒸组、低浓度中药熏蒸组和高浓度中药熏蒸组，每组10只。除正常组外，用弗氏完全佐剂皮下注射建立AA模型。造模成功后，分别采用低、高浓度中药熏I方和蒸馏水进行熏蒸。观察中药熏蒸对足肿胀度，踝关节病理，踝关节炎性细胞因子白细胞介素一18(interleukin-18，IL-Ip)、肿瘤坏死因子一a(tumor necrosis

2、factor-a，TNFa)和细胞间黏附分子一1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM一1)表达及血清中该3种炎性细胞因子含量的影响。论文发表毕业论文结果：治疗后与模型组比较，两种浓度中药熏蒸组大鼠足肿胀程度明显减轻(Po05)，踝关节炎性细胞浸润、纤维组织增生和滑膜细胞增生等病理改变明显好转(P005，P001)，踝关节IL一1B、TNF-a、ICAM-1的阳性表达显著下调(PO05)，血清IL一18、TNFa和ICAM一1含量显著降低(P005)。各熏蒸组之间比较，高浓度中药熏蒸组效果明显优于低浓度中药熏蒸组和蒸馏水熏蒸组(PO05，P001)。结论

3、：中药熏I方熏蒸可有效治疗大鼠AA，其作用机制可能与抑制炎性细胞因子IL一113、TNFo ICAM一1的表达，从而抑制或减轻病变关节的炎症反应有关。关键词：中药熏蒸；佐剂性关节炎；白细胞介素一1口；肿瘤坏死因子一a；细胞间黏附分子-1；大鼠中药熏蒸疗法是一种传统的中医外治方法1，它以内病外治、由表透里、舒筋通络、发汗而不伤营卫为特点，被广泛用于临床各科。目前关于熏蒸疗法的研究大多以临床疗效观察为主。缺乏对机制的研究2。我们在中药熏蒸治疗临床多种关节炎有效的基础上3，观察了自拟熏I方熏蒸治疗大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis。AA)模型的疗效，以及对血清和组织中炎性细胞因子

4、的影响，以探讨中药熏蒸的抗炎机制。1材料与方法11 动物与分组 健康清洁级雄性Wistar大鼠50只。体质量(140士20)g，由第一军医大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK(军)2002-010。随机分为正常组、模型组、蒸馏水熏蒸组(水熏组)、低浓度中药熏蒸组(低熏组)和高浓度中药熏蒸组(高熏组)，每组lO只。12 主要试剂和仪器设备 弗氏完全佐剂(complete Freunds adjuvant，CFA)，Sigma公司产品；白细胞介素一18(interleukin-lp，IL-Ip)、肿瘤坏死因子一a(tumor necrosis factor-a，TNF-a)和细胞间黏附分子-1

5、(intercellular adhesion molecule-1，ICAM一1)酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒，上海森雄科技实业有限公司产品；IL-Ip、TNF-a和ICAM-1免疫组化试剂盒，武汉博士德公司产品。HHW21Cr42型三用电子恒温水槽，广东汕头市医用设备厂产品，改装成自制大鼠熏蒸装置；Microfugel8型低温离心机，美国Beckman公司产品；LEICA-RM2245型组织切片机，德国LEICA公司产品；Lt2-12550型酶标仪，澳大利亚Biocell公司产品；E600型光学显微镜，Nikon

6、公司生产I TKC1481BEC型彩色摄像机，北京杰伟世音设备有限公司生产；PYX一250孓B生化培养箱。广东正一科技有限公司产品。13 熏蒸药物 熏I方，内含羌活20 g、独活20 g、防风15 g、桂枝15 g、细辛10 g、川芎20 g、海风藤30 g、徐长卿30 g、姜黄20 g、苏木20 g、冰片1 g。方中前10味中药由自动煎药机煎成生药浓度为533(体积质量)的中药液保存治疗时分别稀释成体积分数667和333的中药液，冰片待熏蒸治疗前加入中药液中。14造模方法除正常组外，用01 mL CFA于大鼠右踝关节下05 cm处皮下一次性注射建立大鼠AA模型4。至注射后第lo天，大鼠双侧踝

7、关节以下足爪肿胀，AA模型建立成功。15 治疗方法 自造模后第11天开始，正常组和模型组常规喂养，不熏蒸仅每天在熏蒸装置内放置20 min；水熏组、低熏组和高熏组每天分别给予蒸馏水、333中药液和667中药液全身熏蒸。蒸汽温度为3940，20 rain次，1次d，连续10d。16观察指标161 足肿胀度 采用容积测量法n3，第1次在熏蒸治疗煎，以后隔天在熏蒸后30 min测量大鼠双后肢踝关节以下足肿胀的容积(mL)，取平均值，表示足肿胀度。162 踝关节病理 熏蒸10 d后，取踝关节切片。HE染色，参考陈纪藩等一的病理分级标准，在光学显微镜下观察炎性细胞浸润、纤维组织增生、滑膜细胞增生及软骨破

8、坏等。按无、轻、中、重分别以0、1、2、3分表示。163 踝关节炎性因子表达 用免疫组化方法。每组随机抽取10张切片，光学显微镜下选取大鼠踝关节周围视野，显微摄像采集图像保存。用HMIA孓2000高清晰度彩色医学图文分析系统免疫组化测量程序(武汉干屏影像技术有限公司开发)分析图像。以关节周围软骨及软骨下骨组织细胞胞浆染成黄褐色为阳性，根据染色深浅不同，获取阴性、弱阳性、强阳性细胞占视野内总细胞数的百分比。164 血清细胞因子检测 采用ELISA法，分别检测血清IL-Ip、TNFa和ICAM-1 3种炎性细胞因子含量。17 统计学方法 实验数据以is表示，采用SPSS 100统计软件，计量资料用

9、单因素方差分析中q检验(方差齐时)或GamesHowell检验(方差不齐时)；计数资料用Y2检验中的确切概率法；等级资料用非参数检验中的Wilcoxon秩和检验，检验水准a=005。2结 果21 对AA大鼠足肿胀度的影响 造模过程中，死亡3只大鼠，其中水熏组2只，模型组1只。在CFA造模后第11天，大鼠踝关节以下部位明显肿胀，与正常组比较差异有统计学意义(PO01)。熏蒸治疗810 d后，各熏蒸组足跖及踝关节肿胀程度均有所减轻，在第18天时高熏组大鼠足肿胀度与模型组比较，差异有统计学意义(PO05)；水熏组及低熏组大鼠足肿胀度在第20天时与模型组比较，差异有统计学意义(P005)；高熏组在第1

10、8天和第20天时消肿效果明显优于水熏组(P005)。见表1。22对AA大鼠踝关节病理的影响 各造模组大鼠踝关节均存在不同程度的炎性细胞浸润、纤维组织增生和滑膜细胞增生，与正常组比较差异有统计学意义(P001)。高、低熏蒸组的炎性细胞浸润、纤维组织增生和滑膜细胞增生情况较模型组减轻(P005，P001)；水熏虽能降低3项病理评分，但仅在炎性细胞浸润和滑膜细胞增生方面与模型组比较差异有统计学意义(PO05)；高熏组纤维组织增生评分低于水熏组(P005)，滑膜细胞增生评分低于水熏组和低熏组(P001，P005)。病理总评分显示，高熏组、低熏组、水熏组与模型组比较差异有统计学意义(PO05)；高熏组与

11、低熏组、水熏组比较差异有统计学意义(P005)。见表2和图1。由于实验时间较短，仅模型组1只大鼠出现轻微的关节软骨破坏，故软骨破坏未作统计处理。23对AA大鼠踝关节炎性因子表达的影响 各造模组与正常组比较，各炎性因子的阳性细胞(包括强阳性、总阳性细胞)百分比增加明显(P005，PO01)。各熏蒸组与模型组比，水熏组TNFa、ICAMl强阳性细胞百分率低于模型组(P005)；高、低熏蒸组II。一18强阳性细胞，TNFa强阳性和总阳性细胞，ICAM-1强阳性细胞百分率均低于模型组(Po05)；低熏组IL18强阳性细胞和TNFa总阳性细胞百分率显著低于水熏组(P005)；高熏组IL一1|3、ICAM

12、一1强阳性细胞和TNFa总阳性细胞百分率显著低于水熏组(P0。05)。见表3和图2。 12下一页24 对AA大鼠血清中炎性细胞因子含量的影响各造模组IL-IB、TNFa、ICAM-1含量均显著升高，与正常组比差异有统计学意义(P001，P005)。各熏蒸组IL-Ip、TNF-a和ICAM-1的含量均低于模型组(Po05)；各熏蒸组间比较，高熏组3个指标的含量均低于水熏组(Po05)；高熏组ICAM一1含量明显低于低熏组(Po05)。见表4。3讨论中药熏蒸疗法又称为中药蒸汽疗法、汽浴疗法，是根据中医辨证论治的组方原则选配中药进行煎煮，趁热在皮肤或患处进行熏蒸、淋洗，借助药物和温热通过皮肤作用于机

13、体，而达到治疗目的的一种中医学最古老的外治方法。早在原始社会，人们就发现点燃树木来熏熨身体，能减轻病痛。礼记、山海经、五十二病方、内经中均有中药熏蒸疗法的记载1。中药熏蒸以使用方便、适用面广、药简效捷、无创伤、安全可靠和疗效显著等优势而为广大患者所接受，尤其对风湿病关节炎的疗效较为确切，目前临床上仍被广泛应用邓。但对于熏蒸治疗的实验研究不多，有关熏蒸机制的研究更是缺乏。论文发表毕业论文熏I方是作者根据多年临床经验总结而形成的经验方。方中羌活、独活祛风除湿止痛为君；桂枝、细辛温经散寒、祛风止痛为臣；川芎、姜黄和苏木活血祛瘀止痛。即所谓“治风先治血，血行风自灭”之意，与防风、海风藤、徐长卿之祛风胜

14、湿、消炎通络，一并为佐药；冰片辛香走窜，助诸药直达病所为使。全方具有祛风除湿，温经散寒、活血通络之功效。且所选中药大都气味辛香浓烈，具有一定的皮肤渗透力，故对关节炎症有较好的治疗作用。我们在中药熏蒸治疗关节炎临床证实有效的前提下3一，进一步观察了自拟的熏I方对大鼠AA的熏蒸疗效。结果发现，中药熏I方熏蒸治疗能够显著减轻AA模型大鼠踝关节以下的足肿胀。能减轻病理组织学的改变，包括炎性细胞浸润、纤维组织增生和滑膜细胞增生等，提示中药熏蒸治疗大鼠AA有确切的疗效。通过检测在关节炎症中起重要作用的炎性细胞因子IL一1B、TNFa和ICAM-1来探讨中药熏蒸治疗关节炎可能的抗炎机制，发现AA大鼠血液中I

15、L一18、TNF-a和ICAM-1含量显著升高，并且这3种炎性细胞因子在大鼠踝关节局部的阳性表达显著增强，与正常组比较差异有统计学意义。通过中药熏蒸，随着病变关节肿胀的消退和病理变化的改善，各治疗组(包括水熏组、低熏组、高熏组)大鼠血清中异常升高的IL一18、TNFo【、ICAM1含量以及病变关节局部的炎性细胞因子阳性表达均呈现明显的下降，其中高浓度熏蒸的作用更为显著。提示中药熏工方熏蒸治疗关节炎的抗炎机制可能与抑制炎性细胞因子IL一1口、TNFa、ICAM一1的表达，从而抑制或减轻病变关节的炎症反应有关。中医认为，中药熏蒸是通过药物和温热的共同作用而起到治疗作用的。温热本身可疏松腠理、发汗驱邪、疏通经脉、缓解挛急，温热有助于治疗药物作用的更好发挥。作者在实验中发现用蒸馏水熏蒸也有一定的作用证实了这一点，但其中的确切机制还有待深入研究。用动物进行中