非诺贝特对糖尿病大鼠肾组织MCP1、 FN表达的影响

1、非诺贝特对糖尿病大鼠肾组织MCP1、 FN表达的影响    The sea refuses no river.     Knowledge will not be aquired without pain and application.                       作者：

2、袁江永, 谢小娟李英, 王丽梅 One cannot get blood from a stone.  【摘要】  目的: 探讨非诺贝特对糖尿病大鼠肾组织MCP1、 FN表达的影响。方法: 选择健康雄性SD大鼠36只, 随机分为正常对照组(NC组)、 糖尿病模型组(DN组)和非诺贝特治疗组(DF组), 每组12只, 模型组及治疗组以链脲佐菌素诱发糖尿病, 治疗组给予非诺贝特灌胃。分别于第4、 8周观察各组大鼠脂代谢、 血肌酐及24

3、60;h尿蛋白定量。肾组织标本行免疫组化检测肾组织MCP1、 FN的表达水平()。结果: 模型组胆固醇、 甘油三酯、 肌酐及24 h尿蛋白定量水平的表达水平较同期正常组(P<0.01)和治疗组(P<0.05)有明显的增加。模型组大鼠肾组织MCP1、 FN表达较同期正常组(P<0.001)和治疗组(P<0.01)有明显的增加。结论: 非诺贝特可以下调糖尿病大鼠肾组织MCP1、 FN表达对试验性糖尿病大鼠具有部分肾保护作用。 【关键词】  非诺贝特; 糖尿

4、病肾病; 单核巨噬细胞趋化蛋白1; 纤维连接蛋白  糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最严重的并发症之一, 是 DM致死、 致残的主要原因。近来的研究表明单核巨噬细胞趋化蛋白1(monocyt chemoattractant protein1, MCP1)在糖尿病肾病肾组织表达增加, 以炎症形式促进DN进展。非诺贝特广泛用于动脉粥样硬化、 糖尿病等疾病的降脂治疗, 近来动物实验研究发现非诺贝特可以抑制糖尿病大鼠的TGF1

5、而对糖尿病大鼠有部分肾保护作用。本实验我们以SD大鼠建立糖尿病大鼠模型, 用非诺贝特治疗, 免疫组化测定MCP1及FN的表达, 研究非诺贝特肾保护的机制及其与MCP1和FN的关系(医药学/临床医学论文 )。1 材料和方法1.1 材料 体质量180200 g的雄性SD大鼠36只(购于河北医科大学实验动物中心合格证编号: DK04020098)。链脲佐菌素(STZ)(sigma公司, 批号040103); MCP1、 FN抗体、 第二抗体生物素标记的兔抗大鼠抗体(武汉博士德公司)

6、。非诺贝特胶囊(法国利博福尼公司, 批号H20040004)。1.2 方法1.2.1 动物模型建立、 分组 动物随机分为正常对照组(NC组)、 糖尿病组(DN组)、 非诺贝特治疗组(DF组), 每组12只。DN组及DF组大鼠腹腔注射STZ60 mg/kg, 72 h后测尾静脉血糖16.7 mmol/L, 尿糖34, 确定为糖尿病大鼠。1.2.2 给药取材 次日, DF组给予非诺贝特40 mg/(kg·d)灌

7、胃, DN组、 NC组只给等量自来水灌胃, 试验期间, 所有大鼠自由进食水, 不给胰岛素及其它降糖药物治疗。于灌胃4周和8周末, 各组随机选取大鼠6只, 宰杀前1 d置代谢笼, 收集24 h尿, 测尿量并离心, 待测尿蛋白; 先称重, 然后断头取血, 分离血清, 待测血生化; 取肾组织用100 mL/L甲醛溶液固定, 待测免疫组化检查。A faithful friend is hard to find.&#

8、160; 1.2.3 生化指标测定 采用Beckmen全自动生化分析仪测定血糖、 血甘油三酯、 胆固醇、 血肌酐、 尿蛋白, 并计算24 h尿蛋白定量, 结果用体质量矫正。1.2.4 免疫组化染色 组织标本经甲醛固定, 石蜡切片脱蜡至水, 孵育后胰蛋白酶封闭, 加入第一抗体(MCP1、 FN抗体)第二抗体, 再加辣根过氧化物酶标记卵白素复合物, 孵育显色, 树脂封片, 最后用高清晰彩色病理图像免疫测量系统(

9、HPLAS1000)进行分析。MCP1测定: 每张切片随机选取 5个肾小球, 计算每个肾小球内抗体染色阳性细胞数, 以均值表示每例肾小球横切面(glomerulum crosssection, GCS)中阳性细胞数, 计算每张切片皮质区 50个高倍视野下阳性小管数与总肾小管数的百分数, 以均值表示每例肾小管中的阳性率。FN的测定: 每个标本按次序选5个视野, 做灰度扫描, 测定每个视野细胞外基质着色面积, 取其平均值。None but a wise man can

10、employ leisure well.  1.2.5 统计学分析 数据以x±s表示, 所有数据用SPSS13.0统计软件处理, 组间比较用方差分析和q检验。2 结果2.1 一般状况 DN组及DF组在注射STZ后第45日即出现多饮、 多尿、 多食, , 逐渐消瘦, 垫料潮湿甚至成稀泥状, 须每日更换垫料, 而NC组大鼠饮食正常, 体质量增加, 毛色有光泽。2.2 生化测定的比较 DN组及DF组的血

11、胆固醇、 甘油三酯血肌酐及24 h尿蛋白定量均高于NC组(P<0.01), DF组低于DN组(P<0.05, 表1)。2.3 免疫组化肾组织MCP1、 FN的比较 DN组大鼠在第4周及第8周MCP1FN的表达均较NC组高(P<0.01), 治疗后的DF组大鼠MCP1、 FN的表达较DN组有明显的下降(P<0.05), 但较NC组仍高(表2)。表1 鼠血TC、 TG、 Scr及24 h尿蛋白定量表2 大鼠肾组织MCP1与FN

12、的表 论文教育信息网  3 讨论MCP1作为一个重要的趋化因子, 是趋化性细胞因子CC亚家族的一个成员, 是一条由76个氨基酸残基构成的蛋白单链。正常肾组织中多种细胞如肾系膜细胞、 小管上皮细胞、 肾小球内皮细胞等都可分泌微量的MCP1。与本研究结果一致, 说明微量的表达是正常肾脏生理功能所必须。MCP1的主要功能是趋化和激活单核细胞至炎症部位。它与单核细胞上MCP1受体CCR2高亲和力特异性结合, 通过钙离子依赖的PKC介导的信号途径发挥生物学作用。近来研究证明在糖尿肾病的发生发展过程中有炎症的因素1参

13、与。MCP1可以促使炎性细胞如单核巨噬细胞在糖尿病肾病肾组织的聚集, 浸润, 促使细胞外基质堆积、 基底膜增厚和肾小球硬化。本研究显示糖尿病大鼠肾组织MCP1的表达较正常组有明显的上调。Sassy Prigent等2发现糖尿病鼠肾小球血管细胞MCP1mRNA表达的升高。Wada等3在糖尿病伴肾病综合征患者毛细肾小管, 肾毛细血管内皮细胞以及间质浸润的单核细胞中检测到MCP1阳性细胞。结合本文研究认为在糖尿病患者体内, 多元醇代谢通路的激活, 严重的糖激化, 氧化应激产物的形成, NFB、 蛋白激

14、酶C的活化, 以及血管活性激素如Ang、 Ang都可刺激肾脏固有细胞表达MCP1, 使间质浸润细胞产生MCP1。而MCP1趋化单核巨噬细胞, 激活黏附分子, 诱导溶酶体的释放, 活化TGF1, 促进超氧阴离子和胶原的产生, 其中FN的表达增加, 导致DN的进展。经非诺贝特治疗后, 肾组织MCP1及FN表达下调, 糖尿病大鼠尿蛋白定量、 血肌酐有明显的下降。已有研究证实非诺贝特5可以降低糖尿病大鼠肾组织TGF1, TGF1能促进基底细胞分泌和表达MCP14。TGF1的下调有可能使MCP1及FN表达下调。高胆固醇水平刺激肾小球MCP1的表达, 促进单核/巨噬细胞在肾小球的浸润6。本研究中糖尿病肾病大鼠胆固醇升高, 肾组织MCP1的表达增加, 与文献一致。曾有研究认为7非诺贝特可以解除炎症因子抑制的肾小球系膜细胞的胆固醇的排出。可