反义X区RNA和反义P区RNA小鼠体内抗HBV的比较

1、反义X区RNA和反义P区RNA小鼠体内抗HBV的比较 【关键词】 基因疗法；肝炎病毒,乙型；RNA,反义；小鼠,转基因【Abstract】 AIM: To investigate the effect of antisense RNA of hepatitis B virus (HBV) in X region and P region on replication and expression of HBV gene in HBV transgenic mice. METHODS: Recombinant vector plasmids expressing antisense RNA co

2、mplementary to HBV X region and antisense RNA complementary to HBV P region were constructed and injected into transgenic mice through tail vein. The experimental mice were divided into blank, PLXSN, PLXSNasX and PLXSNasP groups. HBV DNA in serum was tested by fluorescent quantitative PCR and Nested

3、PCR. RESULTS: The expression of HBV DNA in serum was inhibited in PLXSNasX group at day 2 after injection and still inhibited at week 8, while it was inhibited in PLXSNasP group at week 4 and reached the lowest at week 8. In PLXSNasX group and PLXSNasP group, the strongest inhibitory effect on the e

4、xpression of HBV DNA reached 58% at the 2nd week and 8th week after treatment respectively. The serum HBV DNA of 2/8 mice in the PLXSNasX group and 1/8 mice in the PLXSNasP group became negative.CONCLUSION: The antiviral effect of antisense RNA in X region of HBV was earlier than that of antisense R

5、NA in P region of HBV. But the difference of antiviral effect between the 2 regions was not significant.【Keywords】 gene therapy; hepatitis B virus; RNA, antisense; mice, transgenic【摘要】目的： 探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)X区反义和P区反义对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响. 方法： 构建表达HBV X区反义RNA和P区反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合，经尾静脉注入小鼠体内，用荧光聚合酶链反应定量法

6、检测血清HBV DNA含量，用NestedPCR法检测血清HBV DNA转阴率. 结果： PLXSNasX小鼠血清HBV DNA的复制于给药后2 d被抑制，至给药后8周抑制依然存在；PLXSNasP小鼠血清HBV DNA的复制于给药后4 wk被抑制，至给药后8周抑制处于上升趋势. 与给药前相比，小鼠血清HBV DNA的复制，在PLXSNasX组和PLXSNasP组分别于2和8 wk达到抑制高峰，抑制率均为58%； 8周后小鼠血清HBV DNA转阴率PLXSNasX组和PLXSNasP组分别为25.0%(2/8), 12.5%(1/8). 结论： HBV 区反义RNA与HBV P区反义RNA对乙

7、型肝炎病毒转基因鼠抗HBV作用效率无显着差异，但区反义RNA的起效时间明显早于P区反义RNA.【关键词】 基因疗法；肝炎病毒，乙型；RNA，反义；小鼠，转基因0引言近年来基因治疗是治疗乙型肝炎的研究热点之一. 而对于反义基因的体外研究已相对成熟12，马春红等3将抗HBV的反义寡核苷酸片段进行体外比较、筛选. 在此基础上，随着乙型肝炎病毒全基因模型的建立4对反义基因的研究逐渐转入体内. 我们在体外实验的基础上5将反义X区RNA和反义P区RNA转染乙型肝炎病毒转基因小鼠，研究其对HBV抑制作用.1材料和方法1.2.1逆转录病毒载体的构建据HBV(ayw)基因序列6,合成互补于HBV(ayw亚型)X

8、区核苷酸1400nt1430nt的X片段以及互补于HBV P 区核苷酸2375nt 2405nt的P片段,利用分子克隆技术将目的片段酶切后反向插入载体质粒的相应酶切位点，构建表达反义RNA的重组载体质粒PLXSNasX, PLXSNasP. 经酶切电泳、PCR扩增和DNA测序鉴定成功构建了HBV反义核酸重组载体.1.2.2脂质体包裹逆转录病毒载体（质粒）的制备脂质体（20 mmol/L）与50 ml/L的葡萄糖按2：3的比例混匀,将等体积的质粒（1 mg/L)迅速加入上述溶液，充分混匀，即得脂质体质粒混合物，室温下反应1h后应用(严格按试剂盒操作说明书进行). 123对乙型肝炎转基因鼠的处理将

9、32只转基因鼠随机分为4组，每组8只. 第1组为Blank(空白对照), 第2组为PLXSN（质粒对照）, 第3组为PLXSNasX（载体反义x区RNA）, 第4组为PLXSNasP（载体反义p区RNA）. 分别在第1, 3, 5 d经尾静脉给每只小鼠注射相应的脂质体质粒混合物200 L，空白对照注射5 ml/L的葡萄糖溶液200 L（试剂盒提供）. 于给药前，首次给药后3, 7 d和2, 4, 8 wk眶静脉采血(在第3 d采血时由于采血过多PLXSN组死亡两只小鼠)，10000 r/min离心10 min分离血清，置-20冰箱备检.124血清HBV DNA定量检测血清HBV DNA按照乙型

10、肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒使用说明进行检测，结果以拷贝数/mL表示，并计算抑制率，抑制率=（给药前拷贝数给药后拷贝数）/给药前拷贝数100%.125血清HBV DNA定性检测按试剂盒操作说明，用NestedPCR方法检测注药前及注药后8 wk血清HBV DNA 20 g/L琼脂糖电泳PCR产物，以条带在230 bp为阳性判断.统计学处理： 用SPSS10.0 统计软件处理. 组间比较用重复测量方差分析. 2结果21反义RNA对乙型肝炎病毒转基因小鼠血清HBV DNA拷贝数PLXSNasX组小鼠血清HBV DNA含量在给药后第2 wk出现明显下降（与给药前相比P0.05）；PLXSNas

11、P组小鼠血清HBV DNA含量在给药后8 wk出现明显下降（与给药前相比P0.05）；对照组小鼠血清HBV DNA含量在给药前后无明显变化（P0.05,表1）. PLXSNasX组小鼠血清HBV DNA含量与空白对照和质粒对照相比有显着性差异（P0.05）；PLXSNasP组小鼠血清HBV DNA含量与其它组相比无差异（P0.05）. 表1尾静脉注射反义RNA对转基因鼠HBV DNA复制的影响（略）aP0.05 vs注射前.22反义RNA对乙型肝炎病毒转基因小鼠血清HBV DNA抑制率与对照组相比PLXSNasX组小鼠血清HBV DNA的表达于给药后第2 d出现抑制，给药后第2 wk达到抑制高

12、峰（58%）,之后抑制作用有所下降，但直至给药后8 wk仍存在抑制；PLXSNasX组小鼠血清HBV DNA的表达于给药后4 wk出现抑制，至给药后8 wk抑制作用增强（58%，表2）.23反义RNA作用后乙型肝炎病毒转基因小鼠血清HBV DNA转阴率给药前及给药后8 wk检测血清HBV DNA，PLXSNasX组有2只（2/8）小鼠血清HBV DNA转阴，转阴率25.0%. PLXSNasP组有1只（1/8）小鼠血清HBV DNA转阴，转阴率12.5%. 空白对照组及质粒对照组所有小鼠血清HBV DNA全部为阳性.表2尾静脉注射反义RNA对转基因鼠HBV DNA的抑制率（略）3讨论一般药物作

13、用于蛋白质水平，而反义技术通过与特定的mRNA特异性结合，从而阻断其表达，达到抗病毒的效果. 反义技术的作用途径主要有4点： 结合后的mRNA不能正确的剪切，正确长度的mRNA不能形成. 结合后的mRNA不能到达正确部位，翻译功能不能进行. 结合后的mRNA激活内源性的RNase，使其很快将被消化分解掉. 反义RNA结合在mRNA分子核糖体结合位点上，使rRNA不能与mRNA结合，蛋白质翻译就不能启动.在我们的研究中，PLXSNasX和 PLXSNasP小鼠治疗8wk后 HBV DNA均有转阴，而对照组全部阳性，说明反义X区RNA及反义P区RNA对小鼠HBV有明显的抑制作用. 其抑制高峰均为5

14、8%，两者的抑制效率无明显差别.反义X区RNA对HBV转基因鼠的抑制出现在给药后3 d，高峰在2 wk；反义P区RNA对HBV转基因鼠的抑制出现在给药后4 wk，至给药后8 wk表现明显下降趋势；反义X区RNA的起效时间明显早于反义P区RNA，在反义X区RNA对HBV转基因鼠的抑制作用逐渐下降时反义P区RNA对HBV转基因鼠的抑制作用才逐渐表现出来；这在反义RNA抑制HBV的细胞实验中未观察到，细胞实验中，相同条件下针对HBV不同区段的反义RNA对HBV抑制的起效时间相同3，5. 这与机体的复杂性有关，HBV DNA 的不同区段有着不同的构形，比较暴露的区段反义基因容易结合，使反义基因很快发挥作用；否则反义基因就要等待目的基因暴露，或用1 杨林，姚集鲁，邓练，等反义基因及反义寡核甘酸抑制乙肝病毒复制和表达的研究J中华传染病杂志，2000，18：13-162 张建军，陈枫，钟森，等乙型肝病毒C区反义RNA靶向肝细胞抗病毒的研究J中华肝脏病杂志，2000，6：169-1703 马春红，孙汶生，刘素侠，等抗HBV最佳反义寡核苷酸片