细胞生物学综合性实验

1、细胞生物学综合性实验课程名称: 细胞生物学实验姓 名: 李春辉班 级: 12级生科（1）班学 号: 2012041106时 间:植物原生质体的分离、纯化及融合引言 原生质体是去除了细胞壁被质膜所包围的、具有生活力的/裸露细胞,对它的研究,可追溯到20世纪60年代英国植物学家Cocking1用酶解方法降解细胞壁,获得了番茄根尖原生质体,自此原生质体的研究得到迅速的发展.1970年Nagata和Takeble2首次报道烟草叶肉原生质体经分离、培养得到再生植株.Carlson3于1972年利用原生质体融合技术从烟草中获得第一个种间杂种,可部分克服有性杂交不亲和性,获得体细胞杂种,从而为创造和选育优良

2、品种找到了一条新途径.近年来,由于原生质体本身所具有的特点及其培养技术与有关的细胞、分子和遗传等学科的交叉渗透,使植物原生质体的研究越来越受到重视.研究领域也从分离原生质体进行的生理生化和利用不同材料的原生质体得到再生植株的阶段转到原生质体的应用(尤其是遗性状改良)方面.前人的研究表明,原生质体不仅可以作为一个单细胞系统来研究细胞壁再生、细胞分裂与分化、摄入细胞器、病毒侵染机理、膜透性及离子转运等基础理论研究的理想材料;而且,近年来以原生质体为材料利用膜片钳技术研究离子通道及原生质体在受光、胁迫和激素作用后的调剂机制已经成为人们所热切关注的问题.与此同时,原生质体也被用来作为研究植物细胞钙信号

3、转导及其调节机制的理想材料4,5.现在人们对利用原生质体导入外源基因及原生质体瞬间表达系统在基因研究中的应用进行了大胆的尝试和实践,目前已经建立对芹菜、玉米、胡萝卜、拟南芥和烟草等植物对不同的外界刺激下信号转导机制的研究6.这对植物遗传转化、性状改良等方面都具有深刻的指导意义7,8.选择分离原生质体的适宜材料是分离原生质体成功的关键9,主要包括基因型、材料的类型及材料的生理状态等3个方面.基因型直接影响原生质体的分离培养效果.不同基因型分离的原生质体产量和活力差别很大10,并直接影响原生质体植株再生11,12.同时起始材料及其生理状态对原生质体的制备和活力的影响也很大13.叶片可以得到大量比较

4、均一的原生质体且不使母细胞受到破坏,许多资料报道双子叶植物分离原生质体的最佳材料是叶片14.此外,子叶、胚轴、茎尖及愈伤组织、悬浮培养物和体细胞胚等均可作为分离原生质体的材料.在木本植物中,愈伤组织或细胞悬浮物是应用最广泛的原生质体培养材料15.但是,采用愈伤组织和细胞悬浮物往往需要经若干次的继代培养才能达到适合分离原生质体的状态;而继代时间的长短在很大程度上影响所获得原生质体的活力和产量16.原生质体的分离方法有机械法和酶解法两种。机械分离法是19世纪末由Klercker首创的,其主要缺点是收获量太小,但具有防止酶对原生质体产生副作用的优点。酶解分离法的优越性是能得到大量有活力的原生质体。由

5、于目前普遍采用的是酶解分离法,所以本实验也采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。由于酶制剂中常含有核酸酶,影响原生质体的活力,可以用降低保温温度或减少酶解时间,提高原生质体的活力.实验证明在原生质体分离的混合酶液中加入一定量的CaCl2.2H2O、KH2PO4具有保护膜的作用17,加入适量的PVP或MES能稳定酶解过程的pH值18.通常用甘露醇、山梨醇、葡萄糖来调节酶液的渗透压.W.巴尔茨(1983)等19认为,代谢活跃的渗透压稳定剂(葡萄糖和山梨醇)与代谢不活跃的渗透压稳定剂(甘露醇)一起使用有利于维持酶液的渗透压.

6、酶解是在2528e的恒温下黑暗或弱光下进行的.酶解后经过400目左右的镍丝网过滤,滤去消解不完全的组织碎块(导管、筛管等)和细胞团.然后将滤液离心,弃去上清液,将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液(CPW)中,再次离心,去上清液,重复3次.在倒置显微镜下检查纯化效果,效果好,用原生质体培养基离心,效果不好,用质量分数为20%的蔗糖离心,使完整的原生质体浮于液面.原生质体融合(protoplast fusion),亦称细胞融合(cell fu-sion)体细胞杂交(somatic hybridization)超性杂交(para-sexual hybridization)或超性融合(parasexu

7、al fusion),是指不同种类的原生质体不经过有性阶段,在一定条件下融合创造杂种的过程20。原生质体融合可避免受精作用中的种的特异性配子识别反应,有可能打破远亲杂交中的有性不亲和界限21。原生质体技术还可用于种质资源的保存、细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入等方面。自1960年Cocking用酶法分离出番茄根原生质体后22, Nagata等首次利用烟草叶分离原生质体,经培养获得再生植株23; 1975年Vardi等首次从木本植物Shamonti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织,并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株24; 1985年Fu-jimura等率先在水稻原生质

8、体培养中获得了再生植株25,已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进,植物细胞融合获得了巨大成功。植物细胞融合技术包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养,以及植株的再生和鉴定等环节。原生质体的融合方法经历了一个逐步改进和完善的过程。在早期原生质体融合的方法有NaNO3法、高pH/高Ca2+法、PEG(聚乙二醇)法,后来逐渐发展为PEG与高Ca2+、高pH相结合;20世纪80年代初又开始探索使用电融合法,并发展出一些其他方法。这些方法各有特点,但目前广泛使用的是PEG法和电融合法。1974年高国楠

9、建立了PEG法,经过不断改进已逐步走向完善,并得到广泛应用26,其融合频率可达10%15%,无种属特异性,几乎可诱导任何原生质体间的融合。在应用PEG进行融合时,重要的影响因素是PEG的种类、纯度、浓度、处理时间、原生质体的生理状况和密度。近年来一些研究建议在PEG溶液中加入融合促进剂(如伴刀豆球蛋白、二甲基亚砜等),可有效提高原生质体的融合频率。最近PEG诱导成对原生质体融合的成功,使得PEG融合技术更精确化,并有可能免除杂种细胞的筛选27。1979年Senda建立的电融合法发展迅速,是目前最流行的融合方法28。但是电融合法需要昂贵的电融合仪,因此目前仍不如PEG法使用普遍。目前正在研究用电

10、脑控制进行自动化操作,以提高操作效率。Li等29建立的激光融合法在融合烟草原生质体时避免了亲本原生质体中叶绿体分布的影响,是近年来比较新的一种方法,但目前研究不多。本实验采用PEG诱导融合法。1 材料、试剂与方法1.1 材料 菠菜叶片,唐古特白刺愈伤组织,金盏菊花瓣。1.2 试剂 （1）.70%酒精，5%的NaClO,灭菌蒸馏水， 0.2mol/LCaCl22H20 ，0.16mol/L CaCl2 * 2H2O溶液，并加有0.1%MES，PH5.8 6.2. （2）酶液A 纤维素酶(cellulase，Onozuka R-10 2 果胶酶(13ectinase，Serva) 1 % (若用国

11、产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。) 甘露醇 0.6 molL CaCl22H2O 0.05 molL MES 0.1 pH 5862 酶液B 纤维素酶(Onozuka R-10) 2 20%和12%的蔗糖溶液，PH5.86.2. 离析酶(Macerozyme R-10) 1 半纤维素酶(hemicellulase，Sigma) 0.2 甘露醇 0.4 molL CaCl22H20 0.1 MESPH5.86.2 （3）PEG溶液 30%（W/V）PEG (NW=6000) CaCl22H2O 10MOL/L KH2PO4 0.7MOL/L （4）高钙稀释液 CaCl22H2O 0.1

12、MOL/L 山梨醇 0.1MOL/L Tris缓冲液 0.05mol/L1.3 方法1.3.1 菠菜叶片和金盏菊花瓣的消毒处理 称取1g叶片，自来水冲洗。然后用5%的次氯酸钠浸泡10min，再用无菌水洗4次。1.3.2 原生质体的分离 将叶片移入大培养皿中，用吸水纸吸去上面的水珠。然后将叶背面朝上，小心用镊子撕去下表皮。将撕去下表皮后的叶片放进预先放有酶液A的培养皿或带盖兰角瓶中，每10ml酶液约放2g叶片。若叶片不易撕下下表皮，可用锋利的解剖刀将叶片切成约0.5mm宽的小条，放入酶液。 将培养皿用石蜡膜带封口，在28条件下保温36h，中间轻轻摇动23 次。在倒置显微镜下检查，直到产生足够量的

13、原生质体 。 1.3.3 原生质体的纯化 刻度离心管中，用600rmin的速度离心5min，使原生质体沉淀下来。 用移液管吸去上清液。将沉淀的原生质体悬浮在2ml 0.2 molL的CaCl22H2O中。用将酶解后的原生质体悬浮液用不锈钢网筛过滤到小烧杯中，以除去未酶解完全的组织。 将滤液分装在注射糙生长针头)向离心簧生部缓缓注入20蔗糖溶液6ml，在600rmin下离心5min。此步完成后，在两相溶液的界面之间将出现一层纯净的完整原生质体带，杂质，碎片将沉到管底。注射器吸出管底杂质和下部的蔗糖溶液及上部的CaCI22H2O溶液。用5ml 0.16mol/LCaCl22H2O悬浮，在600rm

14、in下离心5min，保留沉淀。用3mLCaCI22H2O悬浮。1.3.4 原生质体的融合 将收集到的不同材料的原生质体用0.16moL/LCaCI22H2O悬浮。将两种不同原生质体等量混合。用吸管将混合的原生质体混合液滴在60 的培养皿中，78滴，静置10min,使其贴壁。用吸管将等量的PEG溶液滴在原生质液滴上，静置1015min。用刻度吸管向原生质液滴缓慢加入高PH，高钙稀释液。第一次加入0.5mL，第二次加1mL，第三，四次各加2mL,每次间隔5min。平皿微斜，吸去上清液，缓缓加入4mL稀释液，5min后吸去上清液。用MS培养基如上法洗2次，每次5min。1.3.5 原生质体的培养 每

15、个平皿中加MS培养基4mL,轻轻摇动平皿。用蜡膜密封平皿。置26下进行24h暗培养，然后转到弱光条件下培养。2 结果与分析 用聚乙二醇作为诱导剂的情况下，两个植物细胞能够融合，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。两细胞融合现通常分为五个阶段。两细胞膜接触，粘连；细胞膜形成穿孔；两细胞的细胞质连通；通道扩大，两细胞连成一体；细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。） 计数原生质体的形成率：原生质体形成率=原生质体数/（原生质体数+完整细胞数）100%3 讨 论 从实验结果我们可以看到，原生质体融合的效率并不高，其原因有以下几方面。3.1植物细胞原生质体分离过程很重要，其分离质量直接影响

16、后面融合的效率。因此，酶解分离时一定要注意把握时间的长短，时间过长，则细胞可能被破坏，融合时没有细胞数量上的保证；如果酶解时间过短，则细胞壁不能被完全除去，也影响后面的融合效率。3.2 原生质体融合 3.21 PEG的影响 1.分子量与浓度：细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高，对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，实验时常常采用的PEG分子量一般为10004000，浓度一般为40-60%。 2.PEG的PH值：经验证PEG的PH值在8.0-8.2之间融合效果最好。 3.PEG的处理时间：处理时间越长，融合效果越好，但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限

17、制在1分钟之内。 4.融合时的温度：由于生物膜的流动性与温度成正比，故细胞融合的效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果，在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理温度。 3.22 Ca2+ 的影响 Ca2+浓度对细胞融合有明显的影响。所以在融合液中添加氯化钙溶可促进原生质体融合。 参考文献1 COCKING E C. Amethod for the isolation of plant protoplasts and vacuolesJ. Nature ,1960, 187:927-929.2 NAGATAT, TAKEBE I. Cellwall regeneration and c

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