尼氟灭酸对肝癌细胞增殖的影响

1、Received 2002207201Accepted 2002211207This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No 130270602 and the Foundation for University K ey Teachersby the Ministry of Education of China.3Corresponding author. Tel :+8622923374519; Fax :+8622923246270; E 2mail :sszhou fmmu 1

2、edu 1cn研究论文尼氟灭酸对肝癌细胞增殖的影响田晶1, 陶凌1, 曹云新2, 董玲1, 胡玉珍1, 杨安钢3, 周士胜1, 31第四军医大学生理学教研室、2免疫学教研室、3生物化学与分子生物学教研室, 西安710032摘要:为了观察氯通道阻断剂尼氟灭酸(NFA 对人肝癌细胞(human hepatoma cell line , HHCC 增殖的影响, 我们将NFA 作用于HHCC , 应用细胞计数法及噻唑兰(M TT 比色分析法观察细胞增殖情况; 用流式细胞仪检测细胞周期时相; 并用激光扫描共聚焦显微镜检测Ca 2+i 的变化。结果发现, NFA 使HHCC 细胞数及M TT 光吸收值(O

3、D 较对照组都显著降低, 去除NFA 后, OD 值逐渐恢复。经100mol/L NFA 处理48h 的HHCC 细胞G 1期细胞比例比对照组明显增高, S 期及G 2期细胞比例明显低于对照组。细胞外应用NFA (100mol/L 使Ca 2+i 快速降低, 去除NFA 后, Ca 2+i 可恢复。这些结果表明, 尼氟灭酸能抑制细胞增殖, 其机制可能与细胞内信号转导Ca 2+/CaM 途径被抑制有关。关键词:肝癌; 增殖; 氯通道; 钙中图分类号:Q253; R73517E ffects of niflumic acid on the proliferation of human hepato

4、ma cellsTIAN Jing 1, TAO Ling 1, CAO Yun 2Xin 2, DON G Ling 1, HU Yu 2Zhen 1, YAN G An 2G ang 2, ZHOU Shi 2Sheng 1, 3Depart ments of 1Physiology , 2Im m unology , and 3B iochem ist ry and Molecular B iology , the Fourth M ilitary Medical U niversity , Xi an 710032Abstract :The purpose of this work w

5、as to investigate the effects of niflumic acid (N FA , a chloride channel blocker , on the proliferation of human hepatoma cell line (HHCC . Cell proliferation was ana 2lyzed by cell count and M TT assay. Cell cycle analysis was carried out by flow cytometry. Ca 2+i was determined by laser scanning

6、confocal system. It was found that N FA decreased significantly the cell number and the M TT optical density (OD of HHCC cells , and that the OD value was reversed after washout of N FA. Compared with control , N FA blocked cell cycle progression in G 1phase. Extracellular application of N FA (100mo

7、l/L induced a rapid decrease in Ca 2+i . These findings demonstrate that blockage of chloride channels by N FA induces growth arrest of HHCC in G 1phase , which may be due to the inhibition of Ca 2+/CaM 2dependent signaling pathways. K ey w ords :hepatoma ; proliferation ; chloride channel ; Ca 2+哺乳

8、动物细胞膜上有多种类型离子通道, 研究发现这些离子通道除了与细胞电活动有关外, 还与细胞的增殖1,2、分化3和凋亡4有密切关系。氯通道是细胞膜上介导阴离子跨膜运动的一个通道蛋白家族。最近发现氯通道在细胞增殖中起重要作用。Wondergem 等报道氯通道阻断剂DIDS 、N PPB 、ta 2moxifen 、mibefradil 通过影响容量敏感性氯电流抑制肝AML12细胞的增殖5。而氯通道在肿瘤细胞增61生理学报A cta Physiologica S i nica , April 25, 2003, 55(2 :160-164殖活动中的作用还不清楚。本实验通过观察氯通道阻断剂尼氟灭酸(N

9、FA 对人肝癌细胞(human hep 2atoma cell line , HHCC 增殖的影响, 分析氯通道在癌细胞增殖中的作用机制, 探讨通过抑制氯通道达到控制肿瘤生长的可能性。1材料和方法111材料HHCC 由本校细胞工程中心陈志南教授馈赠。N FA 、噻唑兰(M TT 、胰蛋白酶、ED TA 、HEPES 购自Sigma 。DM EM 购自GIBCO 。112方法11211主要药物配制N FA :用二甲基亚砜(DM 2SO 配成011mol/L 的原液, 4保存, 实验前用DM EM 或台氏液稀释成工作液。DM EM 培养基:按说明书配制, 用1mol/L 的HEPES 调p H 至

10、712-714, 过滤分装, 4保存备用。M TT 溶液:用生理盐水配制, 浓度为5g/L , 0122m 微孔滤器过滤除菌后, 4保存备用。台氏液成分为(mmol/L :NaCl 143、KCl 514、MgCl 2015、CaCl 2118、NaH 2PO 4013、G lucose 5和HEPES 2NaOH 5。11212细胞培养细胞培养于含10%小牛血清的DM EM 培养基(正常培养液 中, 置于CO 2孵箱中,在37、5%CO 2条件下培养。每2d 换液1次, 3-4d 传代1次。11213细胞计数法观察细胞增殖细胞悬液以3×104-4×104每孔的密度接种于2

11、4孔板, 培养12h 后, 吸去培养液, 随机分组(n =3 , 加入正常培养液(对照 或含不同浓度N FA 的培养液, 培养2d 后, 用血细胞计数板计数, 以时间为横轴、细胞数为纵轴做量效曲线。11214MTT 比色分析法观察细胞增殖按照文献6报道方法, 细胞悬液以每孔3×104-4×104的密度接种于24孔板, 培养12h 后, 随机分组(n =4 , 吸去培养液, 加入正常培养液(对照 或含有NFA 50mol/L 或含有NFA 100mol/L 的培养液。每天同一时间, 在每组的随机4个孔中加入80l MTT (5g/L , 并于4h 后小心吸去上清液, 加入20

12、0l DMSO 溶解结晶体。3d 后, 溶液移入96孔板, 用酶联免疫测定仪(Model 550, Bio 2Rad , USA 读取490nm 光吸收值。以往的研究表明, 用M TT 比色分析法, OD 值与细胞数成正比, 可以反映细胞的数量6。11215细胞周期分析将HHCC 细胞悬液接种于3个25ml 培养瓶中, 每瓶约1×105个细胞。细胞贴壁后, 采用常用的血清饥饿法, 使细胞同步化。即:在实验开始前, 先给予无血清培养液处理细胞24h , 使细胞周期停滞在G 0期, 然后给细胞换液, 并随机加入正常培养液(对照组 、含DMSO 的培养液及含有100mol/L N FA 的

13、培养液, 2d 后细胞由70%乙醇固定, PBS 清洗2次, 用含有RNase 10mg/L 和PI 50mg/L 的PBS 在25黑暗条件下染色30min 后, 用流式细胞仪(Elite ESP , Coulter , USA 检测每个周期时相中的细胞比例。11216细胞内C a 2+的测定将HHCC 细胞悬液接种在特制的培养皿上培养2d , 以台氏液清洗细胞2遍, 用fluo 23/AM (10mol/L 在37避光条件下负载35min 后又用台氏液清洗2遍, 然后置于激光扫描共聚焦显微镜(MRC 21024, Bio 2Rad 下扫描7。激发波长为488nm , 检测波长为568nm 。

14、扫描时, 对置于台氏液的细胞进行扫描作为对照, 然后换为含100mol/L N FA 的台氏液作用2min , 最后再换为台氏液。在加药及冲洗过程中, 每10s 扫描1次, 以观察细胞内Ca 2+的动态变化。11217统计学分析实验数据以mean ±SD 表示, 统计差异性检验用t 检验, P <0105为有显著差异。2结果211NFA 对HH CC 细胞增殖的影响用不同浓度N FA 作用于细胞后, 可见当培养液中的N FA 浓度达到60mol/L 时, 细胞数即明显低于对照组(P <0105 ; 当细胞培养液中的N FA 浓度增加到100mol/L 时, 这种抑制作用进

15、一步增加(P <0101 (图1 , 表明N FA 能抑制HHCC 细胞增殖, 并具有浓度依赖性 。图1. 不同浓度NFA 对细胞增殖的影响Fig 11. E ffects of NFA of different concentrations on the proliferation of HHCC. HHCC are cultured with NFA of dif 2ferent concentrations , and the data are assessed by cell count on a haemocytometer. 3P <0105, 33P <0101

16、vs control.161田晶等:尼氟灭酸对肝癌细胞增殖的影响212NFA 对HH CC 细胞MTT OD 值的影响在实验组中, 用50mol/L 和100mol/L 的N FA 处理后, OD 值明显低于对照组(P <0101 , OD 值的变化亦与剂量有关, 较大剂量N FA (100mol/L 处理的实验组, 其OD 值明显低于较小剂量组(N FA 50mol/L (P <0101 (图2A 。去除培养液中的N FA 后, OD 值逐渐恢复(P <0101 (图2B 。表明N FA 抑制HHCC 增殖是可逆的 。图2. NFA 对HHCC 细胞增殖的影响Fig 12.

17、 E ffects of NFA on the proliferation of HHCC. Cell proliferation was measured by colorimetric M TT assay. Data are presented as mean ±SD , n =4wells. A :Dose 2dependent effects of NFA. 33P <0101vs control ; #P <0101vs NFA 50mol/L treated group. B :Reversal effects of NFA. 33P <0101vs

18、control ; #P <0101vs NFA 2treated group.213细胞周期时相改变流式细胞仪结果显示, 对照组G 1期和S 期细胞数分别为5710%、3412%, 增殖指数(S +G 2/G 1+S +G 2 为4311%(图3A ; 而在N FA (100mol/L 作用组, G 1期细胞数明显增多, 为7113%, 而S 期细胞数降到2019%, 增殖指数为2817%(图3B 。重复3次均得出相似的结果(P <0105 。说明N FA 使细胞周期时相发生改变, 抑制细胞从G 1期过渡到S 期, 使细胞增殖停滞在G 1期。DMSO (0112% 对细胞增殖无作

19、用(P >0105 (数据未显示 , 表明N FA 的作用与所用溶媒DMSO 无关 。图3. NFA 对细胞周期的影响Fig 13. E ffect of NFA on the cell cycle of cultured HHCC. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. A :Control. B :In the presence of NFA (100mol/L .261生理学报Acta Physiol. Si n . , April 25, 2003, 55(2 :160-164214细胞内C a 2+的变化用激光扫描共聚焦显微镜动态

20、观察细胞内游离钙的变化, 发现细胞外应用N FA (100mol/L 2min 后细胞内Ca 2+即明显减少, 去除N FA 后约3min , 细胞内Ca 2+水平可恢复到对照水平(P <0105 (图4 。图4. NFA 对细胞内Ca 2+的影响Fig 14. Influence of NFA on intracellular Ca 2+level. Con , control ; NFA , extracellular application of Tyrode s solution containing NFA (100mol/L ; NFA washout , Tyrode s

21、so 2lution containing 100mol/L NFA was replaced by Tyrode ssolution. n =3cells. 3P <0105vs control ; #P <0105vs NFA.3讨论本研究发现, Cl -通道阻断剂N FA 能抑制肝癌HHCC 的增殖, 使细胞增殖停滞在G 1期。细胞增殖是通过细胞周期实现的。细胞周期包括有丝分裂期和分裂间期。分裂间期为细胞分裂做准备, 又分为三期:合成前期(G 1 、合成期(S 、合成后期(G 2 。G 1期是细胞质复制的主要阶段, 蛋白质、RNA 及多聚核蛋白体都在此期合成。氯通道阻断剂N

22、FA 使细胞增殖停滞在G 1期, 提示氯通道可能在细胞增殖由G 1期过渡到S 期这一过程中起重要作用。Ca 2+i 在细胞增殖活动中起重要作用。细胞由静息期到增殖活动期、G/S 的过渡过程、S 期及分裂停止等都与Ca 2+有关8。Ca 2+影响细胞增殖活动与Ca 2+/CaM 依赖性信号转导途径有密切关系, 抑制钙信号转导途径可导致细胞增殖停滞在G 1期, 从而阻断细胞周期的正常进行9,10。本研究观察到N FA 能显著地降低Ca 2+i , 使细胞增殖停滞在G 1期, 提示N FA 抑制细胞增殖可能是通过影响Ca 2+/CaM 依赖性信号转导途径起作用, 其详细机制还需要进一步研究。N FA

23、 是一种常用的Cl -通道阻断剂。目前发现, 它对多种Cl -离子通道均有阻断作用, 如钙激活Cl -通道、容积敏感型Cl -通道以及囊性纤维跨膜电导调节体(CF TR Cl -通道 等。同时研究还表明, 它对其它非Cl -通道也产生影响11。Cl -通道阻断剂影响其它离子通道活动是一种普遍现象。最近我们在心肌上发现, 阴离子替代Cl -和Cl -通道阻断剂(包括N FA 对Ca 2+通道的影响可能涉及到Cl -通道对Ca 2+通道的直接调控作用, 即Cl -通道阻断剂通过抑制Cl -通道, 继而导致Ca 2+通道活性降低, 使细胞内Ca 2+减少11。本文结果显示, N FA 对癌细胞Ca

24、2+i 的影响与在心肌细胞上所观察到的现象非常相似, 提示N FA 的作用机制可能涉及Cl -通道与Ca 2+通道之间的相互作用, 这一假设目前正在进一步验证当中。Cl -通道广泛地分布于各种细胞质膜上, 它们除了在细胞的电活动中起重要作用外, 还与细胞其它的生理活动有关, 例如, 参与细胞的容积和细胞内p H 的调节, 在细胞的增殖和细胞迁移等活动中都发挥一定的作用12。因此, 深入研究Cl -通道与肿瘤细胞增殖的关系, 对于了解肿瘤细胞生理和开发新的抗肿瘤增殖药物有一定意义。参考文献1Rouzaire 2Dubois B , Dubois J M. K +channel block 2in

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