质粒构建-protocol

1、一， 引物设计:1,选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。2，在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。首位20个碱基保护碱基4个上游酶切位点1， 使用word排除目的片段里含有的酶切位点，最后确定所使用的酶。2， 设计引物：primer-up： - -末尾20个碱基的反向互补碱基保护碱基4个下游酶切位点 Primer-down： - -3， 核对-送公司合成。4， 对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10分钟、at 4，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起，at 4保存。二， PCR（P出目的片段）：（一）、从韩

2、家淮实验室赠送的菌液里P出目的片段：1，揺菌过夜： 2ul韩家淮实验室的菌液，15ml离心管 Xul相应的抗生素 3ml LB 94 5min33cycles2,pcr: 菌液1ul 94 30secPcr温度体系Pcr(50ul)反应体系2x PFU mix 25ul 58 30sec Primer 1ul 72 X min2d H2O 23ul 72 5min（X是根据片段的长度设定，500-1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值2）3，跑胶、回收: （1），配胶：煮沸3次1%的琼脂糖胶：大块 称0.6g的琼脂糖 加入60ml的1X TAE 加入0.6ul的EB(待

3、温度降到50-60左右时) 25分钟后，即可点样跑胶。（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4，做胶回收（天根TIANGEN公司的DNA纯化回收试剂盒）:按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65温箱中水浴，并且在加过EB后，放在37温箱中2min。对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul。三， 酶切、链接：1，目的片段酶切：（37酶切过夜或者4小时） insert ：上述胶回收产物 35ul

4、 10 x H buffer（1.5x） 7ul50ul的体系 dd H2O 6ul 酶1 1ul 酶2 1ul2，载体酶切：（37酶切过夜或者4小时） Vector （1ug/ul）：2 ul 10 x buffer（1.5x） 3ul20ul的体系 dd H2O 13ul 酶1 1ul 酶2 1ul为方便以后使用，载体可以一次性多切点。3， 酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。4，连接： 2x Rapid Ligation 6ul Vector 0.8ul12ul的体系 in

5、sert 4.5ul（目的是为了多加点insert） T4 DNA Lignase 1ul四， 转化：质粒 10ul感受态细菌10ul、冰上20分钟-热激：42、90秒-冰上2分钟、加1ml SOC（或者1ml LB），37、180 rpm、45分钟。、将上述转化后的菌液加入到100ml的LB中。再按抗生素：LB=1:1000的比例加入抗生素，（100ml的LB加50ul的2Kx的氨苄）。、250rpm、过夜。五， 质粒大抽：六， 收菌：取过夜菌至50毫升离心管，离心：6000g、3-5分钟、4。再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。（倒置于草纸上使液体流尽)。七， 重悬：每管加入8ml

6、的RES-EF(RnaseA)，重悬细菌沉淀充分Vortex或用枪头吹打沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。3，裂解： 每管加入等量的LYS-EF bufffer，即8ml。轻轻上下颠倒离心管4-6次，（勿震！）室温放置5min，使细菌完全裂解，溶液透明，无团块或絮状物。注意：vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染4，平衡：滤芯插入柱子，将柱子驾于50ml离心管上（或者直接架于50ml离心管架上）：取15ml EQU-EF buffer 沿滤芯四周加入充分平衡滤芯。注意：离心管内的液体不要浸没滤柱的头，所以要勤于倒弃滤液，在过滤平衡液的同时，

7、进行5、6步，防止滤芯干掉。5，中和：在等待EQU-EF buffer滤完时，往裂解好的菌液中加入8ml NEU-EF buffer，颠倒混匀，冰上孵育5min。（不能vortex）6，离心、过滤：离心中和过的菌液：10000rpm、5-10min、at 4-质粒存在于上清中。（离心使沉淀更加紧密，更集中于管底，对于进一步提高质粒质量会有所帮助）：将上清吸入到平衡好的滤芯中,重力自流尽。7，洗一：过滤完毕后，吸取5ml的FIL-EF buffer，沿滤芯四周加入（将粘在滤芯上的质粒洗下来）-过滤完后，将滤芯弃掉。8，洗二：往滤柱中加入35ml的ENDO-EF buffer去内毒素9，洗三：待滤

8、完后再加入15ml的wash-EF buffer过滤。10，洗脱：取一支干净的15ml超速离心管，将滤完的柱子插入到离心管中，用高压条将二者绑好，往滤柱中加入5ml Elu-EF buffer.(Elu-EF buffer预先放在50的恒温箱中加热，可提高洗脱效率)11，沉淀：待Elu-EF buffer滤完后，弃滤柱，往离心管中加入5ml的异丙醇（将质粒沉淀下来），混匀（充分vortex），静止10min-10000rpm、30min、4-弃上清。12，洗涤：加5ml的70酒精（ETOH）或用15ml三蒸水（高压过）+35ml的无水乙醇配制（在超净台进行），混匀（上下颠倒即可），离心：10000rpm、10min、常