引物设计原则及酶切位点选择和设计

1、引物设计原则及酶切位点选择和设计 ：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用 整理 载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去， 你需要体大量的载体来T 连入质粒中的重要目的酶切， 所以感到还是直接扩增好一点。 但这就需要你仔细设计引物。 扩增出靶基因的时候在核就是进行酶切和连接， 当然首先就是在想要合成或者是进行PCR可以在质粒的图谱说明书上酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的， 找取相应的位点，进行设计。 （一）设计引物前应做的准备工作： 准备载体图谱， 大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析， 确定一下那些酶切位点不能

2、用 准备一本所买公司的酶的商品目录， 便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用 （ 二）设计引物所要考虑的问题往往导致两个， 所连接片断上没有这两个位点， 且距离不能太近， 两个位点应是载体上的，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。 只能切一个， 酶都切不好。 因此，紧挨在一起，还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如 promega 的说明书上说，最好隔四个。我看 AGATCTTAAG这样的位点比较难切。两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补） ，否则效果相当于单酶切。 最好使用酶切效率高的。 的酶。 最好使用双酶切有共同 buffer 最好使用自己实验室有的酶， 这样可， eco

3、r1等） ，最好使用较常用的酶（如 hind3 ， bamh1 以省钱。 的问题，很多的战友都有疑惑。其实园子里有很多的解释了。的计算，关于TmTm 大家可以理解，双链溶解所需的温度。即是DNA 叫溶解温度（ melting temperature, Tm ） ， Tm 因此，的溶解是没有作用的。而不互补的区域对DNA这个温度是由互补的 DNA 区域决定的， （除时，只计算互补的区域Tm 才有贡献。计算Tm 只有和模板互补的区域对对于引物的 Tm， 过低， 是因为他们误把保护碱。 不少战友设计的引物都Tm非你的酶切位点也与模板互补）反应的诸多困难。所以，设计引里了，最后的结果是导致了 PCR基

4、和酶切位点都计算到 Tm 以度以上 （我喜欢控制在 58Tm 控制在 55 物的时候， 先不管 5'端的修饰序列，把互补区的，再加上酶切位点和保Tm）的具体情况，对于困难的PCR,需要适当提高上，具体根据 PCR温度高的引物就Tm护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。的公式。 2+43'非特异结合等问题。简单的计算公式可以用比较容易克服3 发卡、二聚体及，不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点 90 若你计算的 Tm 值达到了快个碱基，去3329 、的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为多度，实际用的只 7021 个碱

5、基。引物公司给的单子是掉酶切位点和保护碱基，分别为17 、55度扩的结果也差不多。有 50度，用其它关于 Tm值的计算，有用PP5.0进行评价的，需要考虑的参数包括： base number 、 GC%、 Tm、 hairpin 、 dimer 、 false priming 、 cross dimer 。退一般退火温度为 Tm-5 度， 退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去， 如上所言， PCR几个循环后， 引物外侧的序列已经参入了扩增片断中， 所以你可以在预变性后多加几步， 温度比你 Tm 值低些 （这样可能会增加非特异性） ， Tm 值是你包括酶切位点及保护碱基的 Pr

6、imer 计算出来的。1.一般在5'端加保护碱基，如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-VECTO越者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基2.有人的经验加入酶切位点的引物可以和未加入时使用相同的退火 结果也还是令人满意。,温度或是其他设计引物的软件进行计算一下，看看引物之间的关于引物二聚体，最好用 primer 时可以提高一下退 G （自由能）的绝对值，如果小于10, 一般是问题的。如果稍大，PCR没火温度，一般是没有问题的。如果3' 端形成二聚体，并且自由能绝对值较大，如果PCR 有条带，建议重新设计引物。此外，所加的三个核昔酸的保护序列经过尽心设计有时也可以降低二聚体的

7、G 一个特异性引物一在设计酶切位点时，最好能尽可能多的利用引物本身的碱基。这是因为， 左右了。而我们在般都是20bp 左右，再加上酶切位点序列和保护性碱基，大致就是28bp 如果我 们设计退火温度时，与引物的长度有关，比正常的引物 （20bp） 的 Tm 肯定要高一些。 能利用引物自身的部分序列，就可以有效地减少引物的长度。还有， 有些酶是离不开末端序列的， 因此， 在设计一个酶位点时， 最好把该酶的性质弄清楚 端添加酶切位点， 设计时限制性酶切位点是应该在5' 端的顶端。 在设计引物时， 常在 5 以利于 PCR产物连接到载体。' 3。先用软件设计出合适的引物，引物的设计引物

8、时保证在最后5 个核苷中含有3 个 A 或 T 端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，G。 （容易错配）引物3' 端最佳碱基的选择是应尽量避免在引物 3' 端的第一位碱基是A 因为他们形成的碱基配对比较稳定。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和和 C， 值时并不包括这些序列，5'端而不影响特异性。当计算引物 Tm 启动子序列，可以加入到引物 但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。 两个酶切点 ，酶切位点都需要保护碱基以利于内切酶的有效切割。酶切位点前加保护碱基1 在做载体构建的时候设计引物扩增片段进行定向连接，除了酶切位点， 个碱基，至少隔上3 产物

9、很难被酶切，因此就会导致连接PCR还要在两端加一个三个核昔酸的保护序列，否则有的酶因为内切酶需要一定的辅助性碱基才能顺利切割，在没有辅助碱基的情况下，失败， ，他们不需要辅助性碱基即可切割，但大部分酶是需要辅和SpeI 是可以切割的，比如：SalI' +引物配对区3 助性碱基的。所以引物顺序应是： 5' 保护碱基+酶切位点下面是几个战友的讨论，请问：在引物的 5端加限制酶切位点，只在酶切位点的5端加保护碱基可以吗？还是必须要在酶切位点的两侧加保护碱基？是的，只要在5端加保护碱基可以了。其实保护碱基就是要给限制性内切酶一个结合位点， 3端还有更长的引物序列在， 当然不需要再加保护

10、碱基了， 下面就来讨论一下这个问题： （下面 引自 NEB 网站） 1、寡核苷酸近末端位点的酶切为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。 （ 这里用的是寡核苷酸！ ！ 而不是末端带酶切位点的肽链！ ）实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时） ，或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。然后NEB就提供了一个表，关于链长和切割效率的。我觉得这只能说明酶在作用于识别位点时所需占据的链长， 并不能说明在设计酶切位点时要加那么长的保护碱基， 比如我用的 NotI ， 要加 10 个碱基， 切 2

11、5 个小时才 95的效率， 这还是用了 20 倍的酶量！我师姐只加了 4 个碱基，也没见出现问题。2、线性载体近末端位点的酶切将线性载体与相应内切酶（10 units/ ag）在适宜温度及缓冲液条件下反应60分钟，随后进行连接和转化。切割效率=100%-（酶切产物转化子数/ 再连接产物转化子数 近末端碱基对数指的是从识别位点到 DNA 末端的碱基对数， 但并不包括最初切割位点处留下的单链突出碱基。 （解释一下：就像下面这个例子EcoRI 酶切位点NNNG AATTCNNC TTAAG它的近末端碱基对数就是3，而不是4）还没有证据表明单链核音酸能否提高切割效率，因此在设计PCR引物时应至少加上

12、4个额外碱基。Not I 7 100 （2） Bluescript SK- Spe I4 100 （1） Bluescript SK-Ksp I1 98 （2） Bluescript SK Xba INotI 拿酶切位点的设计与保护碱基的选择Chai n% CleavageEnzymeOligo SequenceLength2 hr20 hrAccIGGTCGACC800CGGTCGACCG1000CCGGTCGACCGG120AfliIICACATGTG800CCACATGTGG10>90>90CCCACATGTGGG12>90>90AsciGGCGCGCC8>

13、90>90AGGCGCGCCT10>90>90TTGGCGCGCCM12>90>90AvalCCCCGGGG850>90CCCCCGGGGG10>90>90TCCCCCGGGGGA12>90>90BamHICGGATCCG81025CGGGATCCCG10>90>90CGCGGATCCGCG12>90>90agioCAGATCTG800gaagatcttc1075>90GGAAGATCTTCC1225>90BSSHIIGGCGCGCC800AGGCGCGCCT1000TTGGCGCGCCAA1250

14、>90BstEIIGGGT(A/T)ACCC9010BstXIAACT G C AG AALC AA 1 GLA 1 1 GG2200AAAACTG CAGCCAATGCATTG G AA242550CTGCAGAACCAAT GCATTG G ATGCAT2725>90ClalCATCGATG800GATCGATC800CCATCGATGG10>90>90CCCATCGATGGG125050sEcoRIGGAATTCC8>90>90CGGAATTCCG10>90>90CCGGAATTCCGG12>90>902HliMMCCCC-AC

15、KXGC7 TTCCGGCCCCAAHodinCAACCTTCCCAACCT7CXCCCAAGCTTGGG5CCCTACCC8GGXCCCCCGGGGTACCCCGMUt3GC6CCGACGCGTCGZcolCCJT8GCATGC* ATGGCATG«WI-GGCCO1AG8CGCCATATCCCGCCTrrCATATCAAACCCGGAA1TCCA1ATGGAA11CCGCGAATTCCATATGGAATTCCCre>ciGGOAGCCCCGCTAGCCCCTAGCTAGCTAGNOUTTGCGCCCGCAA0AEGCKXGCEA10AAATATGCGCCCCCTATAAAl

16、eATAAGAATGCGCCCCCTAAACTA725Nd)TGCATCCA7CCA10rrAATn.- ArTRRTTrTRrAGTTPactTTAATTAA0CTTAATTAAC0COT-G0P«elCTTTAAAC0GCTHAAACC0Wtttaaaccc0AGCTTTL"I!XAACCCCCCCCCCC75PstIGCTGCAGC800TGCACT GCAGTG CA141010AACIGL口1也匚LdAIGLAI1GG22X。>90AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA24>90>90CTG CAGAA CCAAT GC ATTG GA

17、TG CAT2600PvulCCGATCGG8QQATCGATCGAT101025TCGCGA7CGCGA120IDSadCGAGCTCG81010SacllGCCGCGGC8007CCCCGCGGGGA1250XOSallGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800GCCTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCCG301050ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA321075SealGAGTAC1C81025AAAAG1 tC 1 1 | 1127575SmalCCCGGG6010C<CCGGGGB010CCCCCGGGGG101

18、050TCCCCCGGGGGA12>90>90GACTAGTC810>90GGACTAGTCC1。10>90CGGACTAGTCCG120SOCTAGACTAGTCTAG140EDSphIGGCATGCC800CATGCATGCATG12025StulACATGCATGCATGT1410504AGULL r I8>Q0>90GAAGGCCTTC10>90,90AAAAGGCCTTTT12>90>90XbalCTCTAGAG80CGCTCTAGAGC10>90>9DTGCTCTAGAGCA1275>90ctagtctagac

19、tag147S>?OXholCCTCGAGG800CCCTCGAGGG10102SCCGCTCGACCGG121075XmalCCCCGGGG80CC8CCGGGGG102575CCCCCCGGGGGG1250>90TCCCCCCGGGGGGA14>90>90酶寡核甘酸序列切割率%2 hr20 hrNot IAATTGCGGCCGCIIIAAIII GCGGCCGCTATAAAAAATAT GCGGCCGCATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTATAAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA0101025 250101090 >90Nsi

20、 IGCATGC ATGCATTGGTTCTGCAGTTCCA ATGCAT10 >90>90>90Pac ITTAATTAA CG TTAATTAA GGCC TTAATTAA000025 >90Pme IGIIIAAAC CGIIIAAAC GCCGIIIAAAC GGGGCGCGCCGG GIIIAAAC AGCIII000 7502550 >90Pst ICCTGCAG G TGCA CTGCAG TGCAAACCAATGCATTGG CTGCAG AACCAATGCATTGGAA CTGCAG AAAAAACCAATGCATTGGATGCAT CTGCA

21、G010>90>900010>90>900Pvu IGC CGATCG ATATCGATCG CGATCG CGATCG010 0025 10Sac IGGAGCTC C1010Sac IICCCGCGG G GGA CCGCGG TCC0 500 >90Sal IGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GTCGAC GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA010 10050 75Sca IGAGTACT C IIIAGTACTAAA .10 752575Sma IC

22、CCGGG GCCCCGGG GGCC CCCGGG0010Ava IGGATCC CCCGGG GCCCGGG C10 >9010BamHGGCC CCCGGG GGATCC CCCGGG50>950 >9I NdeGGGATCC C GCATATGC GG CATATG CC0>900>9IGCG CAIAIGCGC AAACCC GGGIII CAIAIG1000>90000>90250000Spe I Bgl II Nhe ICACTAGT G CCACTAGT GGCCG ACTAGT CGG CTAG ACTAGT CTAGCGGGATCC

23、 CG GCG GGATCC CGCGAGATCT CTCAGATCT GAGAATTCCGGAATTC CATATGGAATTCCCGGGAATTC CATATG CGGCTAGCCGGCTAGC CG101000>90>900757575010>90>905050>90>900>90>90>90025Sph I BssH IIC GCATGC G ATG GCATGC CATATGT GCATGC ACAT TCCAGATCT GGA CGGCGCGC CTAG GCGCGC TAGGCTAGC CTA001025001002550>9000 50Stu I BstE IITAGGCCT A TCAGGCCT GA IIIAGGCCT AAACAATTG GCGCGC CG GGT(A/T)ACC>90>90 >90500>90>90>90>9010Xba I BstX I Cla IGTCTAGA C GCTCTAGA GCGCATGC TCTAGA CTAGCTAG TCTAGACCAATGCATTGG AACTGCAGAAAAAAAACTGCAG CCAATGCATTGGATGCAT CTGCAGAA CCAATGCATTGGGATCGAT