变性高效液相色谱_一种新的基因突变检测方法

1、变性高效液相色谱一种新的基因突变检测方法*方能虎*蔺 丽 任吉存 吴 旦(上海交通大学化学系 上海200240摘 要 变性高效液相色谱是近年来发展起来的一种检测基因突变及多态性的新方法。相比其它检测技术,它具有易普及、经济、快速等特点。本文对该项技术在国内外近几年的研究进展进行了评述。关键词 变性高效液相色谱 基因突变 检测中图分类号:65717;Q754 文献标识码:A 文章编号:1005-281X(200502-0343-07Denaturing High Performance Liquid ChromatographyA Novel Technique for Detection of

2、 Genetic Mutation P PolymorphismsFang Nenghu*Lin Li Ren Jicun Wu Dan(Department of Chemistry,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,ChinaAbstract Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLChas been successfully used for the genetic mutation P polymorphisms analysis.Compared with c

3、onventional slab gel electrophoresis,this technique is sensitive,ef -fective and economical.The fundamental aspects and the development of the applications of this technique in recent years are revie wed.Key words denaturing high perfor mance liquid chromatography;genetic mutation;detection一、引 言基因突变

4、是指基因组DNA 分子在结构功能上发生碱基对组成或排列顺序的改变,主要包括碱基的替换和小片段的缺失或插入,它是导致基因型疾病的重要原因之一1,2。而多态性是指在进化过程中已经在人群中积累起来的DNA 序列变化。基因突变及多态性分析在生物医学研究中,尤其是在基因型疾病诊断及病理研究中有着非常重要的作用。随着人类基因组整体测序计划的发展,探索基因突变及多态性的任务变得十分迫切。理想的基因突变及多态性检测技术应当具有准确性和敏感性高、完全自动化、检测成本低等特点,而且在聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PC R引物的修饰及PC R 后处理等方面也不应有特殊的要求。传统

5、的基因突变及多态性检测方法大都依赖于平板凝胶电泳技术3。这些方法或受检测灵敏度的限制4、或因易于产生假阳性结果和高成本检测5,6、或因只能手工操作导致分析时间冗长等原因,不适用于大量临床样品分析和大规模人口扫描分析。近年来毛细管电泳-激光诱导荧光技术为基因突变及多态性分析提供了一种高效、快速、灵敏、高通量的新方法7,8。然而该技术需配备昂贵的激光诱导荧光检测器,且需要寻找合适的荧光标记物,难以在临床研究和应用中普及推广。高效液相色谱法由于分离效率高、选择性好以及同时具有分离和检测功能,已经发展成为分离和分析生物大分子(如核酸、蛋白质等的强有力手段。该方法应用于核酸研究主要有6种分离模式9:尺寸

6、排阻色谱(size -exclusion chromatography、阴离子交换色谱(anion -e xchange chromatography 、混合模式色谱(mixed -mode chromatography 、反相色谱(reversed -第17卷第2期2005年3月化 学 进 展PROGRESS I N C HE MISTRYphase chromatography、离子对反相色谱(ion -pair re -versed phase chromatography、亲和色谱(affinity chrom -atography。在这几种分离模式中,阴离子交换色谱和离子对反相色谱由

7、于具有较高的分辨能力和分析单、双链DNA 片段大小范围宽等特点10,11,应用较为广泛。尤其是离子对反相色谱法(IR -RP -HPLC被公认为是检测核酸较理想的方法12。1986年,Eriksson 等13曾采用以多孔硅胶为载体的PepRPC(C 2P C 18色谱柱分离了DNA 片段。然而,欲分离600bp 以上的DNA 片段需耗时3h 以上,冗长的分析时间限制了该方法在实际分析和制备方面的应用。上世纪90年代初,随着无孔苯乙烯、二乙烯苯共聚物(poly (styrene -divinylbenzene,PS P DVB填料的问世,加快了分析速度,并解决了样品峰过宽及拖尾等柱效低的问题,才

8、使这一技术在蛋白质分离14及DNA 片段分离等方面的应用得以快速发展15。但发掘这种技术的潜在能力并应用于探索人类基因组DNA 序列变异却是在近几年刚刚兴起。基于DNA 变性与复性对温度的依赖性,离子对反相高效液相色谱法可以按以下3种方式操作:(1在不变性温度条件下,高效液相色谱仪类似于凝胶电泳仪,可分离分子量不同的双链DNA 分子,制备分子克隆所需的DNA 片段或分析具有长度多态性的片段,类似于限制性长度多态性分析和扩增片段长度多态性分析;(2在充分变性温度条件下,该方法能区分单链DNA 或RNA 分子,适用于寡核苷酸合成纯度质量控制和基于引物延伸的基因型分析;(3在DNA 部分热变性的温度

9、条件下,杂合型和野生型的PCR 产物不仅分别形成同源双链,同时也错配形成异源双链。由于同源双链与异源双链解链温度的差异,使固定相保留它们的能力有所不同。因此根据保留时间的差异可以分辨异源双链与同源双链,从而识别杂合型。此法也称为变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatogra -phy,DHPLC。本文着重对近几年来国内外采用第三种分离模式D HPLC 技术在基因突变及多态性分析中的应用研究进行评述。二、变性高效液相色谱基本原理Oefner16在1995年首次提出变性高效液相色谱的概念,即把在接近DNA 解链温度条件下进行的离 子

10、对反相色谱分析称为DHPLC 法。1998年Kuklin等17,18把同样的技术称为温度调控异源双链分析(temperature modulated heteroduplex analysis,TMHA。2000年我国学者侯一平等19则建议把在接近DNA 解链温度条件下进行的,旨在探索与发现DNA 序列变异的离子对反相液相色谱技术称为温度调控高效液相色谱法(temperature -modulated high -performance liquid chromatography,Tm HPLC。本文仍沿用Oefner 提出的名称。DHPLC 技术的原理是基于未解链的和部分解链的双链DNA 在

11、部分失活条件下具有不同保留的性质。这种部分失活条件可以采取升高温度的手段获得。所有基因组DNA 的单拷贝均可通过PCR 反应大量扩增,杂合子个体的DNA 经扩增产生异源双链(heteroduple xes,由于错配位点的氢键被破坏,因此在异源双链上形成/鼓泡(bubble0,导致它与纯合子个体的DNA 扩增产物完全匹配的同源双链(homoduplexes的解链特征不同。在部分加热变性的条件下,异源双链DNA 分子更易于解链形成Y 形结构,与固定相的结合能力降低。当流动相中乙腈浓度梯度增大时,异源双链将先于同源双链被洗脱出来,带有突变序列的样品呈现出异源双链和同源双链混合物的峰形特点,而不含突变

12、序列的样品则只有同源双链的峰形(图1。据此可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段,从而提供有无突变的信息,是一种快速、高效、准确、经图1 D HPLC 技术检测DNA 序列变异的实验流程Fig.1 D HPLC for the genetic mu tation analysis#344#化 学 进 展第17卷济并可半自动化地进行基因突变及多态性检测的技术。三、变性高效液相色谱的色谱柱分离性能优越的固定相是色谱分析技术成功运用的关键。DHPLC技术的迅速发展正是得益于新型柱填料的不断出现。目前,应用于DHPLC的色谱柱有以下3类2022:(1使用23L m无孔PS P DVB聚合

13、物微粒,表面键合C18固定相作为填料的DNASep o R 分析柱(Transgenomic公司;(2苯乙烯、二乙烯苯单体、引发剂和致孔剂等混合物在石英毛细管内采用原位合成方法制备而成的整体柱(monolithic co-l umn;(3使用315L m硅胶表面键合直链硅烷固定相作为填料的Zorbax Eclipse dsDNA分析柱(Agilent 公司。DNASep o R分析柱由于采用了表面键合C18的热稳定性好、耐高温的PS P DVB微粒为柱填料,从而保证了分析结果的准确性和重复性。利用离子对反相液相色谱模式分离核苷酸,实现了梯度洗脱条件下双链DNA(dsDNA片段的尺寸依赖性分离,

14、而以前只能通过电泳实现2123。Herbert22和Huber20对整体柱的研究结果显示该类色谱柱的通透性和重现性好,具有高效和高分辨率地分离单、双链DNA片段的能力。Arnold等24比较了PS P DVB填充柱和PS P DVB整体柱对同源双链和异源双链的分辨能力,在前500次进样中,两者没有显著差异;但在500次进样后,整体柱分辨异源双链和同源双链的能力会迅速下降。Huber等20的实验显示两种色谱柱进行核苷酸分离时,整体柱具有较长的洗脱时间,但是两种色谱柱均可应用于基因分析工作中。由于PS P DVB整体柱的使用,在提高通量方面已成为可能25,并且整体柱的一个显著优点是与质谱在线联用的

15、可行性20。Halee m等26比较了DNASep o R分析柱和Eclipse dsDNA柱分离DNA片段的能力:25e时,Eclipse ds-DNA柱对小片段有较好的分离,而对大片段则分辨率下降;在4050e时两种柱对不同片段的DNA均有较好的分离效果。DNASep o R分析柱和Eclipse dsD-NA柱在分析同源双链和异源双链时,分辨率上并无显著差异,但在使用寿命上有较大的差异。Eclipse dsDNA柱由于在中性和碱性环境中的不稳定性,仅能进样分析10002000次,而且需要在每200次分析后用100%的乙腈冲洗45min进行再生27。而DNASep o R分析柱可以进样分析

16、超过6000次,且不需要进行特别的再生处理。蔺丽等采用Eclipse dsDNA 柱在优化的色谱条件下对 X174P Hae digest DNA 的片段进行了分离28,并采用D HPLC技术对亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T突变进行了分析29,取得了较好的实验效果。新的研究证实,在完全变性条件下,DHPLC的分辨率已达到能够对相同尺寸单链DNA分子中已知多态性基因型的单个碱基差异作出检测,它完全有可能检测除单个C-G颠换外的所有可能的碱基转换。而且在完全变性条件下, IP-RP-HPLC的高分辨能力和序列依赖性的单核苷酸保留特性相结合,可以检测短片段(100bpPCR 产物30。具有良好的

17、传质性能的固定相也是HPLC分析核酸等生物大分子的重要条件之一。改善生物大分子在固定相上传质性能的途径主要包括:(1增加孔径和减小微粒直径31;(2采用无孔载体填料的固定相32;(3通过使用表面型孔填料来减少孔的深度33;(4引入贯穿固定相颗粒的流通孔34;(5使用整体柱35,36,其分离介质是含有微孔、中孔和大孔的多孔高分子聚合物37,38,流动相直接流过孔,通过对流加强传质交换,从而提高柱效3941。四、变性高效液相色谱的检测方法目前在核酸分析领域与HPLC联用的检测手段有紫外(ultraviolet photometric detector,UV、荧光(flu-orescence det

18、ector、质谱(mass spec trometry,MS等。其中紫外检测器(UV凭借其良好的通用性成为应用最为广泛的检测器,但灵敏度不高的弱点使其使用受到一定的限制42。在核酸分析和一些突变扫描方法中有时需要更高的灵敏度,这时具有更高灵敏度和选择性的荧光检测器成为首选43。但是荧光检测器要求使用荧光标记物,且通常使用的染料如吖啶黄、溴化乙锭44,45是有毒物质。Scaiano实验室开发出SYB R Green染料46不仅具有更好的灵敏度,而且使用更安全47。激光诱导荧光是目前灵敏度最高的检测方法之一。Hecker等48采用荧光标记PC R引物、激光诱导荧光方式进行检测,证明DHPLC方法可

19、以区别含量相差500倍的两个等位基因,这使多份样本的混合检测成为可能。同时荧光标记单链,使色谱图的解释变得更加容易。美国Transgenomic公司在WAVE o R核苷酸片段分析系统技术平台基础上,开发出一种后荧光检测技术。在所有分析条件不变的情况下,被检测的核酸片段经DHPLC分离之后在混合室中与荧光试剂混合,然后#345#第2期方能虎等变性高效液相色谱一种新的基因突变检测方法进行检测,不仅可以提高灵敏度上百倍,而且不需要昂贵的荧光标记引物49。近年来电喷雾离子化-质谱(EIS -MS作为一种重要的结构分析工具与IR -RP -HPLC 联用也已应用于核酸分析领域50,该联用技术不仅可以确

20、证被分离的单链DNA 的成分特性,还可以确证扩增的PC R 产物的基因型20。众所周知,在核酸的质谱分析中为了获得高置信度的分析结果,对分析物进行适当的脱盐和去除小分子量杂质是必不可少的51,这也正是HPLC -MS 的魅力所在,但质谱的高成本使该项技术较难推广使用。五、变性高效液相色谱技术在基因突变及多态性分析中的应用自Onfne r 等建立DHPLC 方法以来,美国Trans -genomic 公司开发出了能以不变性温度、充分变性温度和部分变性温度3种方式操作的离子对反相液相色谱自动分析仪,称为W A VE TMDNA 片段分析系统。最近Varian 公司也开发出基于变性高效液相色谱分析的

21、Varian c s ProStar Helix D HPLC 分析系统。在国外已有较多的实验室和研究中心开始采用W A VETMDNA 分析系统,成功地进行基因突变及多态性的检测以及疾病相关性研究25。在国内此项技术也已受到关注,并开始应用于疾病相关候选基因的突变检测52,53。表1列出了近年来在这方面的研究情况。从表中可以看出,目前DHPLC 技术应用于基因突变及多态性分析主要是采用商品化的WAVETMDNA 分析系统。但国内外也有一些研究机构在普通的高效液相色谱仪上进行DHPLC 分析工作,这些表1 D HPLC 在基因突变及单核苷酸多态性分析中的应用Table Lists of mut

22、ation and SNPs screened partly by DHPLCgene diseaseref.genediseaseref.P53n breas t and ovari ancarcinomas as well as lung,col on and skin cancer 54Fanc A n Fanconi ane mia group A 55LPL m coronary atherosclerotic heart disease52 HPR T nLesch -Nyhan dis eas e Juvenile onset dermatomyositis 56i mmunog

23、l obulin V -region n 57TSC1TSC2n tuberous sclerosis -1、25860CF TR n cys tic fi brosi s 30,61PTEN n gli oblastoma30FBN1nMarfan s yndrome and related connective ti ssue disorders 61 NF1nneurofibromatosis 62EX T1EX T2n multiple exostoses 63human B -globin n B -thalassemia64,65hM LH1、hMSH2n hereditary n

24、onpolyposis col orec tal cancer 66,67 Y chromosome n68factor IX n hemophilia B 62BRCA1、BRCA2n breas t cancer 6973factor VIII n hemophilia A 74BTK gene n X -linkedaga mmagl obuline mia 75HNF -1A 、GCK n dibetes76D MD P BMDnDuchenne P Becker muscular dys trophy77SUO X gene n autos omal reces sive disea

25、se 78G6P T1gene n glycogen storage dis ease 79APP 、PS1、PS2n Alzheimer .s disease 80PKD1、P KD2n autos omal dominantpolycystic ki dney di seas e 81HVR1、HVR2n breas t cancer 82KHSRP n febrileconvulsions 83APOD n84CYP2A6gene p l ung cancer 85M TM 1n X -linked myotubul ar myopathy86 PRL 、PRLR n multi ple

26、 sclerosis 87MPP4n retinitis pigmentosa88GABRG2n s evere myoclonic epileps y of infancy 89HNF -4a n type 2dibetes 90RPGR n retinitis pigmentosa 91PKHD1nautos omal reces sive polycystic ki dney 92ATM n gas tric cancer 93AA -N AT(263G P Cn94GAL T genemtrans ferase -deficient galactos ae mia 95TCR -V D

27、 2-D D 3P D D 2-D D 3n chi ldhood acutel ymphoblastic leukemia 96M THFR(C677Tmneural tube defects 、occlusi ve vascular,et al 29,97,98PHA gene n phenylketonuri a(P KU99MCCD1n100n:WAVE TM D NA analytical s ys te mp :Vari an c s ProStar Heli x D HPLC analytical system m :generalHPLC实验表明:在有梯度发生器和色谱柱温控装置

28、的普通高效液相色谱仪上进行DHPLC 分析工作是可行的,它为目前以凝胶电泳技术为基础进行基因突变分析提供了一种新的、具有普遍适用和推广意义的技术选择。六、结 论DHPLC 技术既不需要放射性同位素,也不需要凝胶,操作简便、经济,真正做到了自动、高效、快速、准确地检测DNA 片段,且检测结果以图形表示,直观、易于判断,为与疾病相关的基因突变检测提供了#346#化 学 进 展第17卷一种有效的技术手段。DHPLC不仅用于已知突变的检测,还可以用于未知突变的扫描。这项技术的发展对于发现新突变或多态性,可减少测序工作量。尤其对于鉴别稀少的变异型,可明显降低成本,加快实验的进程。此外随着DHPLC功能不

29、断地开发和拓展,还可被广泛应用于DNA微卫星鉴定、肿瘤杂合性缺失的检测、RF-PC R的竞争性定量、人种遗传学分析、基因作图、核酸中自身剪切反应的研究、DNA片段大小测定、寡核苷酸的质量控制和纯化、CpG岛甲基化的分析及细菌鉴定101,102、mtDNA研究103等许多基因组研究领域以及包括死亡年龄鉴定和性别鉴定等法庭应用中104和mRNA的检测中105,106。和其他方法一样,DHPLC技术也有一些不足之处107如:不能直接检测出纯合突变,只能提供个体样本有无突变的信息,但无法得出具体的突变类型;当有多个片段需要检测时,由于有多个解链温度,需要多步检测,增加了工作量等。尽管如此,在目前的检测

30、手段中,DHPLC仍是一种快速、高效、准确、经济及半自动化筛查基因杂合突变的工具78,优于测序等其他分子生物学方法,相信在未来的基因组学研究领域中必将继续发挥重要的作用。参考文献5Wang D G,Fan J B,Si ao C J,et al.Science,1998,280:10771082ties,1996,17:3623669Huber C G.Bi opol ymer Chromatography.Chiches ter:John Wiley&Sons Ltd,2000,2615716412师治贤(Shi Z X,王俊德(Wang J D.生物大分子的液相色谱分离与制备(Separa

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