PCR实验室设计说明

1、PCR实验室设计说明 PCR实验室分为四个区域，进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出，四区域分别为：1.试剂配制区n2.样品处理区n3.核酸扩增区n4.产物分析区n如使用全自动分析仪，区域可适当合并,三四区可合并为扩增产物分析。各区的功能是：    1.1.1 试剂准备区：扩增试剂的配制、分装和保存。    1.1.2 样品处理区：样品登记、分装；核酸提取、保存和加样。    1.

2、1.3 扩增产物分析区：扩增产物的测定、结果分析、登记及报告。    1.2 扩增前区与扩增后区应严格分开，须使用不同的房间，两区之间最好有一定的间隔。    1.3 使用商品化试剂盒可在样品处理区进行少量试剂配制。    1.4 在满足下列操作和清洁处理要求的前提下样品处理区和试剂准备区可设在同一房间内：    1.4.1 在生物安全柜内操作。    1.4.2 每个实验人员、实验组分别使用各自的试剂及耗

3、材。    1.4.3 盛放污染材料的器皿密封并一次性使用。    1.4.4 用有效的方法对操作区域和共享器具在实验前后进行清洁及消毒。设计要求： PCR实验室可以是分散形式，也可以是组合形式,现要主要是以组合形式为主流。完成一组PCR实验，通常应经过试剂配制、样品处理、核酸扩增及产物分析四个实验过程，若实验工艺需要，还应增加样品粉碎过程。一、分散形式PCR实验室    所谓分散形式PCR实验室，是指完成上述实验过程的实验用房彼此相距较远，呈分散布置形式。对于这种布置形式的PCR实验

4、室，由于各个实验之间不易相互干扰，因此无需特殊条件要求。二、组合形式PCR实验室    所谓组合形式PCR实验室, 是指完成PCR四个实验过程的实验用房相邻布置，组成独立实验区域的形式。对于组合形式PCR实验室，由于各个实验间集中布置，容易造成相互干扰，因此，对总体布局以及屏障系统具有一定的要求。各室在入口处设缓冲间，以减少室内外空气交换。试剂配制室及样品处理室宜呈微正压，以防外界含核酸气溶胶的空气进入，造成污染,可以通过控制进风风量大于排风风量达到正压效果。核酸扩增室及产物分析室应呈微负压，以防含核酸的气溶胶扩散出去污染试剂与样品，可以通过控制排风风量大于进风风

5、量达到负压效果。在理想情况下，PCR实验室缓冲间内，可设置正压，使室内空气不流向室外，室外空气不流向室内。PCR实验室进风由原有中央空调控制，要求将中央空调风口安装到指定定点，且高度为地面铺装好后2600mm处。如果使用荧光PCR仪，扩增室和产物分析室可以合并。若房间进深允许，可设PCR内部专用走廊。需要指出的是在减少室内外空气交换方面，缓冲间比专用走廊更有意义。    各个区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验之间的相互干扰，防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。 实验室的墙体，包括顶棚，应结构牢固、

6、气密性好；所有阴角宜采用圆弧形线条过渡；墙体内壁光洁、不吸附、耐腐蚀、易清洗消毒；地面材料应满足无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求。如果使用荧光PCR仪，扩增室和产物分析室可以合并。若房间进深允许，可设PCR内部专用走廊。需要指出的是在减少室内外空气交换方面，缓冲间比专用走廊更有意义。    各个区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验之间的相互干扰，防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。 实验室的墙体，包括顶棚，应结构牢固、气密性好；所有阴角宜采用圆弧形线条过渡；墙体内壁光洁、不吸附、耐腐蚀、易清洗消毒

7、；地面材料应满足无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求。主要设备试剂准备区  仪器设备主要有冰箱、超净台、加样器、混匀器、天平和离心机等，加样器、天平除了要专用外，还应有定期校准。   试剂分装应在超净台中进行  扩增反应混合液应使用分子生物学级的，试剂制备好后应有质检：一是否有污染、二是检测试剂的扩增效果。标本制备区  仪器设备主要有生物安全柜、加样器、离心机、温育仪、混匀器等扩增区  扩增区的主要仪器是核酸扩增仪、超净台、微量加样器、离心机、可移动紫外灯。扩增仪需进行校准。并配备UPS电源，以防

8、止由于电压的波动，停电对扩增效果的影响。分析区  本区所使用的仪器设备有酶标仪、洗板机、加样器和水浴箱等洁净实验区的缓冲间部分面积不能超过主实验室的八分之一,这是有规定的.1、  主体结构：主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。2、  标准的四区分隔和气压调节：将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增，产物分析四个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免

9、受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。可打开缓冲区，缓冲区和 PCR 扩增区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。3、 消毒：在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在试剂准备区和标本制备区 还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。4、 不锈钢传递窗：试剂和标本通过机械连锁不锈钢（不建议使用电子连锁方式）传递窗传递，保证试剂和标本在传递过程中不受污染（人物分流）。5、 地面地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面，整体性好。便于进行清扫，耐腐蚀。6、 照明灯具要选用净化灯具，能达到便于清洗、不积尘的特

10、点。在建设的过程中应注意：规范的安装流程和全面的服务流程。严格按照规范科学设计的安装流程。安装前需要确定以下安装条件，如：电源电压，电源进线位置，电话网络线进线位置，进水水压，最小安装空间，地面平整度，通风孔、进水管和下水管的位置等，理想状态的空间尺寸 样本处理区三、工作区域及设备要求    （一） 试剂储存和准备区    1、2-8C和-15C冰箱    2、混匀器    3、微量加样器（覆盖1-1000ul）    4、移动紫外灯（近工作台面）    5、消耗品

11、：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）    6、专用工作服和工作鞋    7、专用办公用品    （二） 标本制备区    1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱    2、高速台式冷冻离心机    3、混允器    4、水浴箱或加热模块    5、微量加样器（覆盖1-1000ul）    6、可移动紫外灯（近工作台面）    7、生物安全柜  

12、0; 8、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）    9、专用工作服和工作鞋    10、专用办公用品    如需处理大分子DNA，应具有超声波水浴仪。    （三） 扩增反应混合物配制和扩增区    1、 核酸扩增仪    2、 微量加样器（覆盖1-1000ul）    3、 可移动紫外灯（近工作台面）    4、 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）

13、0;   5、 专用工作服和工作鞋    6、 专用办公用品    (四)扩增产物分析区    视检验方法不同而定。基本仪器设备如下：    1、 微量加样器（覆盖1-1000ul）    2、 可移动紫外灯（近工作台面）    3、 消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）    4、 专用工作服和工作鞋    5、 专用办公用品5.人员和样品的安全是由生物安全柜和定向气流共同来保证。PCR实验室设计规程中规定

14、人员和样品必须单向流动。即从 “试剂准备区到样品制备区，再从样品制备走向扩增区和产物分析区”，绝对不能反向流动，以辟免交叉污染。气流方向只规定试剂准备区为微正压或常压，样品制备区为常压或负压，扩增区和产物分析区为负压，压力梯度是从试剂准备到产物分析区，是高到低的。规程并没有规定要做成全新风系统，但是为降低交叉污染的风险，建议做成全新风系统。1 概述    临床基因扩增实验又称PCR实验，是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法，测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定

15、的病毒。由于该检测方法可以测出普通检验难以检测出的病毒并具有灵敏度高、特异性高、快捷、对样品要求低等优点，因此被临床医生广为认可，已广泛应用于医院的临床诊断和各防疫检测部门的禽疫病诊断。但是，这种实验需要有能保证绝对安全、配置合理的实验室和非常规范的操作为前提。近年来对临床基因扩增检验实验室的建设越来越得到重视，因为它对检测结果的可靠性、准确性和安全性起到至关重要的作用。本文主要从临床基因扩增检验实验室的平面布局，空调通风系统设计、气流控制和污染的防制几个方面对    实验室设计中的主要特点进行了阐述。    临床

16、基因扩增检验实验室设计的核心问题是如何避免污染。因此，实验室的平面布局、空调通风系统设计、气流控制等都是围绕这个核心问题进行的。下面就对这几个方面分别进说明。2 PCR实验室平面布局    临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区标本制备区扩增反应混合物配制和扩增区扩增产物分析区。    各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。

17、60;   PCR实验室平面布置示意图如图1所示。图1 PCR实验室平面布置示意图3 实验室空调通风系统设计及压力控制    PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。同时，要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。    3.1 试剂贮存和准备区    该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的

18、材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。    对与气流压力的控制，本区并没有严格的要求。    3.2 标本制备区    该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。    本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶

19、所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。    3.3 扩增反应混合物配制和扩增区    该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。    本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避

20、免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。    3.4 扩增产物分析区    该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。    本区是最主要的扩增产物污染来源，因此对本区的压力梯度的要求为：相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。4 污染的预防与控制    PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中，

21、常见的有以下几种污染类型：扩增产物的污染；天然基因组DNA的污染；试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染，实验就必须停止，直到找到污染源为止，而且实验结果必须作废，需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐，浪费人力物力。因此要避免污染，首先应是预防，而不是排除。    4.1 工作区域的严格划分    （1）各个实验区域设置合理；    （2）各个实验区域要有明显的标记（如醒目的门牌或不同的地面颜色等），以避免各个不同实验区域设备

22、物品、试剂等发生混淆。    4.2 合理的系统设置    （1）合理的空调通风系统设置，尽量采用全送全排的空调系统；    （2）严格的气流压力控制，保证不同的实验区内不同的压力要求。    4.3 规范的操作    （1）临床基因扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训，经培训合格后才能从事临床基因扩增检验的工作；    （2）在实验

23、操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施；    （3）清洁工作及时、正确。实验工作结束后，必须立即对本区进行清洁。除常规的消毒液体对表面进行擦拭消毒或紫外线灯的照射消毒外，对一些实验设备还应进行高压消毒处理。    4.4 严格的管理    （1）严格控制进出实验室的人员。与实验无关的人员不得随意进出实验室，有条件的情况下要设置独立的通道和进出整个实验区的门；    （

24、2）在各个实验区域使用带有明显区别标志的工作服（如不同颜色），当工作人员离开时不得将本区的工作服带至其它区域；    （3）尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。    （4）扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源，废液不能在实验室中倾倒，必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉，用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理，如焚烧等；    （5）扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。 &#

25、160;  4.5 完备的实验室配套设施    完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件，应根据各个实验室实验内容的不同配备相应的设备和仪器，如超净工作台、离心机、加样器等。PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。同时，要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。    3.1 试剂贮存和准备区    该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料