紫萼藓科植物DNA提取及遗传多样性的分析

1、收稿日期:2005-08-02基金项目:黑龙江省骨干教师项目资助。作者简介:张晗(1979- , 女, 植物遗传学硕士研究生, 从事种质检测研究工作。山东农业科学Shandong Agricult ural Sciences 2006年第1期紫萼藓科植物DNA 提取及遗传多样性的分析张晗1,2, 高永超3, 沙伟2, 李汝玉1, 戴双1(11山东省农业科学院作物研究所, 山东济南250100;21齐齐哈尔大学生命科学与工程学院生物系, 黑龙江齐齐哈尔161006;31山东省科学院中日友好生物技术研究中心, 山东济南250014摘要:采用随机扩增多态性DNA (RA PD 方法对两种紫萼藓科植物

2、的6个居群的多样性分析。用11个随机引物扩增出清晰谱带52条。:然聚为两大支, 一支为东亚砂藓, 另一支为毛尖紫萼藓。尖紫萼藓的遗传变异情况。关键词:DNA提取; 紫萼藓科;RA PD ; 中图分类号:Q78;Q94935:1001-4942(2006 01-0007-03Study and genetic diversity in grimmiaceaeZHAN G Han 1,2, Gao Y ong 2chao 3,SHA Wei 2,L I Ru 2yu 1, DA I Shuang 1(11Crop Research I nstitute , S handong A cadem y

3、of A g ricultural S ciences , J inan 250100, China;21De partment of B iology , College of L i f e Science and Engineering , Qiqi har Universit y , Qiqi har 161006;31B iotechnology Research Center of S handong A cadem y of Sciences , J inan 250014Abstract The genetic diversity of sixty individuals of

4、 six pop ulations of Gri m mi aceae were ana 2lyzed by rando m amplified polymorp hic DNA (RA PD markers 152loci were amplified by using 11random p rimers 1The result s showed t hat six nat ural pop ulations of Gri m mi aceae were clustered into two off shoot s R acomit ri um canescens and Gri m mi

5、a pili f era ,after t he genetic variability analysis and cluster analysis.K ey w ords Ext raction DNA ; Gri m mi aceae ;RA PD ; Genetic diversity 紫萼藓科(Gri m mi aceae 紫萼藓属(Gri m 2mi a 和砂藓属(R acomit ri um 的毛尖紫萼藓(Gri m mi a pili f era 和东亚砂藓(R acomit ri um canescens 为典型的小型旱生藓类, 植物体粗壮, 密集或松散丛生, 主要生长在裸露的

6、岩石表面或岩石表面的薄土或砂土上。上无树木遮蔽, 下无湿润的土壤, 而且, 单层细胞的叶片没有特殊的抗旱、抗寒及抗紫外线的结构, 其生存机理是否与其特殊的遗传物质有关还有待进一步研究。以往国内对苔藓植物的研究大都集中在分布、形态、细胞等方面13, 分子生物学方面的研究较少, 对紫萼藓科植物的研究更少, 到目前为止对紫萼藓科植物分子方面的研究未见报道。本试验采用随机扩增多态性DNA (RA PD 方法对上述两种紫萼藓科植物的6个居群的60个个体进行遗传多样性研究, 以初步了解两种藓类植物的DNA 提取条件和居群的遗传多样性。1材料与方法111试验材料采自五大连池(位于黑龙江省的北部地区, 地处中

7、高纬度。地理坐标为东经1260612626, 北纬48364850 的石龙山、黑龙山和火烧山的火山岩上, 样品距离1015m , 采集后室温培养, 其上覆盖一层塑料膜, 以保持水分。112试验方法 711211DNA 的提纯普通的C TAB 4法提取毛尖紫萼藓和东亚砂藓的DNA 较容易降解, 针对这两种藓类都属于小型旱生藓类及其特殊的生活环境2, 主要从以下几个方面找出最佳试验条件: ED TA 浓度分别采用60mmol/L (E 1 、50 mmol/L (E 2 、40mmol/L (E 3 、30mmol/L (E 4 、20mmol/L (E 5 进行试验; -巯基乙醇的浓度为0(1

8、、015%(2 、1%(3 、115%(4 、2%(5 ; 将核糖核酸酶配制成10、20、30、40、50g/ml 5种浓度; 对不同生活状态材料的DNA 进行提取。用紫外分光光度计检测DNA 模板的浓度, 用018%的琼脂糖凝胶电泳、EB 染色、紫外灯下观察照相, 结果DNA 带清晰、无拖尾现象, 表明DNA 质量较好。11212引物筛选100随机引物(10bp 、25l选。11条引物, 全两种紫萼藓科植物的总DNA 样品的扩增, 即:SBSA -04、SBSA -11、SB 2 SA -12、SBSB -01、SBSB -12、SBSB -18、SBSC -01、SBSC -02、SBSC

9、 -04、SBSC -11和SBSC -14(其序列如表1 。表1筛选出的各个引物及其序列引物序列引物序列SBSA -04AA TCGGGCT G SBSC -01TCGGCGA TA G SBSA -11CAA TCGCCGT SBSC -02GT GA GGCGTC SBSA -12TCGGCGA TA G SBSC -04CCGCA TCTAC SBSB -01GT T TCGCTCC SBSC -11AAA GCT GCGG SBSB -12TCGGCGA TA G SBSC -14T GCGT GCT T G SBSB -18CCACA GCA GT11213PCR 扩增及产物检测用

10、筛选好的11条随机引物(10bp 对全部的样品DNA 进行PCR 扩增, 根据所需稀释基因组DNA 的浓度, 反应总体积为25l , 其中dN TP 为75mol/L , 引物为0175mol/L , 基因组DNA 为30ng , T aq 酶115 U , 其他成分为无菌双蒸馏水。扩增的程序为: 944min 1个循环; 941min ,35115min , 722min ,40个循环; 7210min 1个循环; 4保存。扩增产物检测:扩增结束后, 在反应混合物中加入5l/ml 上样缓冲液(上样液含0125%溴酚蓝和40%(W/V 蔗糖水溶液 , 混匀。取15l 点入含0125g/ml 溴

11、化乙锭的115%琼脂糖凝胶中, 用1TB E 电泳缓冲液在3V/cm (84V 的电场下电泳2h 左右, 然后在紫外凝胶成像系统 下观察照相和分析。11214数据处理为了保证良好的可重复性, 选取清晰、稳定、重复性好的谱带用于最终的数据分析。根据Tadara D G L2000标准分子量, 依据统一的标准, 有带记为“1”, 无带记为“0”, 缺失数记为“1”, 形成0/1矩阵图, 根据软件的需要输入计算机。用POP GEN E 1100版软件计算东亚砂藓和毛尖紫萼藓居群分支情况, 按照U P GMA 法进行聚类分析。2结果与分析211的最佳条件, L , 015%-巯基乙醇浓度50mg/ml

12、 , 新鲜材料。在此, 重新对上述样品进行电泳, 结果显示, DNA 的质量和纯度较高, 谱带清楚且均匀。经紫外分光仪检测,A 260/A 280比值在11751185之间(图1 。图1提取基因组DNA 的紫外吸收光谱212扩增结果及分析用筛选好的11条引物对紫萼藓科植物的6个自然居群的样品进行RA PD 扩增。每个引物的扩增片段在39条之间, 利用11个随机引物共获得52条谱带, 即共检测到52个位点, 平均每个引物检测到4173个位点。213两种紫萼藓科植物遗传多样性分析由表2可以看出, 各居群间的遗传多样性差别比较大。其中, 火烧山东亚砂藓的居群(H S 具有最多的多态位点数(41 以及

13、最高的多态位点数比率(78185% 、Nei s 基因多样性(012654 、Shannon s 指数(014021 , 遗传多样性最高; 石龙东亚砂藓居群(S S 的各指标均最低, 遗传多样性最低; 火烧山毛尖紫萼藓居群(H Z 的遗传多态性也较低, 石龙毛尖紫萼藓居群(S Z 、黑龙山东亚砂藓居群(HS 和黑龙山毛尖紫萼藓居群(HZ 的各指标居中, 遗传多样性逐渐减小。由表3的从属间分析可知, 毛尖紫萼藓和东 8亚砂藓之间存在明显的遗传差异, 且毛尖紫萼藓的遗传多样性较丰富, 东亚砂藓的遗传多样性相对贫乏。表2紫萼藓科植物6个自然群体的遗传变异居群 个体数总位点数多态位点数多态位点比率(%

14、Nei s 基因多样性Shannon s 指数HS 10523669123012433013657 S 011925012723 HZ 10523567131012282013472 S 011839012651 S S 10523057169012149013190 S 01204901293 S Z 10523771115012475013730 S 011889012672 H S 10524178185012654014021 S 011809012496 H Z 1052315916201206101 S 0101居群平均1052356713101S 001注:S, ; HZ 指黑龙

15、山毛尖紫萼藓;S S ; S Z 指石龙毛尖紫萼藓; H S 指火烧山东亚砂藓; H Z表3东亚砂藓和毛尖紫萼藓的遗传变异居群 个体数总位点数多态位点数多态位点百分比率Nei s 基因多样性Shannon s 指数东亚砂藓3052458615012510013902 S 011686012275毛尖紫萼藓30525198108012833014406 S 0149001878214居群间聚类分析聚类结果显示, 紫萼藓科两种植物的6个自然居群显然聚为两大支。一支为东亚砂藓, 黑龙山东亚砂藓居群与火烧山东亚砂藓居群先聚类, 然后再与石龙东亚砂藓聚类; 另一支为毛尖紫萼藓, 黑龙山毛尖紫萼藓居群先与

16、石龙山毛尖紫萼藓居群聚类。表明距离较近的居群遗传上很明显地优先聚类。3结论与讨论311两种紫萼藓科植物的遗传多样性苔藓植物是植物界的一个重要门类, 属孢子植物, 为高等植物的一个重要分支。一般结构较简单, 以矮小的身躯和广泛的适应性为特征。它以独特的生活方式代表着植物界从水生向陆生的过渡类型。苔藓植物具有丰富的遗传多样性5, 其生物多样性较人们普遍的概念和印象要丰富和复杂得多。尤其在我国, 气候类型多样, 地貌类型丰富, 苔藓植物资源幅员辽阔, 是世界上苔藓植物 种类最丰富的国家之一。试验结果表明, 火烧山东亚砂藓的居群在6个居群中具有最高的遗传多样性, 石龙东亚砂藓的居群具有最低的遗传多样性

17、, 火烧山毛尖紫萼藓的居群的遗传多样性较低, 石龙毛尖紫萼藓居群、黑龙山东亚砂藓居群及黑龙山毛尖紫萼藓居群的遗传多样性逐渐减小, 遗传差异的大小可能与各自的生长环境、所处的地理位置及自身的生理机制有关。312RA PD 试验注意事项在试验及数据处:(1 DNA 的纯度6,7arg y rop hy ll a , 模板中; 而DNA 模板中残、SDS 、CTAB 、异丙醇等往往影响扩增结果, 这主要是因为这些未被除尽的小分子有机物, 直接影响了T aq 聚合酶的活性。因此, 提取DNA 时, 要把小分子有机物的含量降到最低, 从而减小对PCR 扩增的影响。(2 条件的一致性:试验药品、流程要相同

18、; 电压恒定、电流时间一致、琼脂糖的浓度一致、读带的标准始终一致, 最大限度减少人为误差。(3 严防污染:由于采用较低的退火温度及短的随机引物,RA PD 对污染非常敏感。共生物、寄生物以及标本保存过程中出现难以预料的变化, 都可能影响RA PD 结果。提取模板DNA 之前, 要用双蒸无菌水清洗标本; 加样过程中注意防止污染; 试验中应设空白对照, 以排除系统误差。(4 勤换电泳缓冲液:多次使用的电泳缓冲液内存在杂质, 易产生拖尾或者谱带模糊不清的现象, 影响电泳效果。参考文献:1中国科学院昆明植物研究所编著1云南植物志M 1昆明:云南科学出版社,2002,18:330234312J Fridovich 1The biology of oxygen radical J 1Science , 1975,201:875288013Pallitt K E , Y oung A J ,Alscher R G 1Anti