骨骼肌特异性蛋白酶与蛋白降解

1、骨骼肌特异性蛋白酶与蛋白降解张 勇收稿日期： 基金项目: 国家自然科学基金 “钙蛋白酶调控猪体蛋白降解的信号途径研究”，编号30972112作者简介: 张勇(1972-)，男，甘肃武威人，教授，博士，硕士生导师，主要从事分子营养学、饲料生物技术的研究。Emai: syndzhy 邓 科2(1.沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳 110866; 2.沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳 110866)摘 要：骨骼肌特异性蛋白酶（calpain-3,p94,CAPN3）是钙蛋白酶系统的一员，与肌细胞生成和细胞凋亡密切相关，同时也被认为参与了蛋白降解过程。本文主要从骨骼肌特异性蛋白酶的结构功能和生理活性，

2、并结合近年来国际上的研究成果来分析骨骼肌特异性蛋白酶在骨骼肌蛋白降解中的作用。关键词：骨骼肌特异性蛋白酶;肌联蛋白;蛋白降解骨骼肌特异性蛋白酶calapin-3（p94,CAPN3）是钙蛋白酶（calpains）的一种。Calpain-3并不是肌肉生长所必须的蛋白酶，却在维护肌肉完整性中发挥了至关重要的作用。钙蛋白酶在骨骼肌中主要存在于Z线处，calpain-3在骨骼肌中与肌联蛋白（titin）紧密结合在一起。肌联蛋白有将粗肌丝与Z线相连，维持肌原纤维（myofibril）的完整性和稳定性的功能，同时肌联蛋白和伴肌动蛋白（nebulin）是N2线（N2 line）的组分。肌原纤维蛋白降解的第一

3、步必须是肌原纤维分解成肌丝，超微结构研究表明N2线是宰后钙蛋白酶最先降解的结构之一。因此本文依据近年来国际上的研究来讨论Calpain-3在骨骼肌中的功能和作用。1 骨骼肌特异性蛋白酶的结构钙蛋白酶主要由两种广泛存在的钙蛋白酶（ubiquitous calpains）：-钙蛋白酶(-Calpain，Calpain-1)和m-钙蛋白酶(m-Calpain，Calpain-2)，及骨骼肌特异性钙蛋白酶（Calpain-3，p94）组成。前两者都由2个亚基组成，分子量相近，但两者表现最高活性所需的钙离子浓度不同，前者为微摩尔级（112 mol/L），后者为毫摩尔级（250750 moL/L），Cal

4、pain-3与前两者结构相似。通过不同来源的钙蛋白酶cDNA序列可以发现calpain-1和calpain-3大亚基均由4个结构域组成（见图1），两者均包含域，和，域是N-末端域，域是蛋白水解的区域，域的功能未知，域是由四个EF手组成的主要的钙离子结合域。Calpain-3有三个额外的插入区域，即NS区，与前肽IS1区和结合肌联蛋白的IS2区。图1 骨骼特异性蛋白酶calpain-1和calpain-3的结构Fig.1 Schematic of calpain-1 and calpain-3 proteins2 骨骼肌特异性蛋白酶的活性 研究表明1，全长度的calpain-3是没有活性的，它必

5、须自溶（即水解自身）删除IS1区（被认为是前肽）以获得活性（见图1）。这个自溶过程需要钙离子的参与2。自溶后，获得一个可以与底物和抑制剂结合的酶活性位点3。通过蛋白质电泳与免疫印迹实验4，可以观察到自溶后全长度为94 kDa的蛋白，依据钙离子浓度和时间不同，可进一步分解成60，58和/或55 kDa的产物（用抗体定向到IS1区C-端）。Calpain-3在体内最初是以它的降解形式（即有活性形式）被发现的，它在转录后会立刻自溶，因此难以提取5，目前有研究显示4-6,calpain-3在骨骼肌细胞中低钙离子浓度下（2.5 mol/L）与calpain-1相比在一段时间内更稳定。与广泛存在的钙蛋白酶

6、不同的是内源性钙蛋白酶抑制蛋白（calpastain）及其它的外源性抑制剂如亮肽酶素和钙蛋白酶抑制剂和等，对calpain-3的IS1区裂解是没有抑制效果的3。 另外，除了通过分子内和分子间方法水解自身外，calpain-3还没有其它明确的内源性底物3-7。通过确定calpain-3的生理学底物来说明它在在骨骼肌中的生理作用是很重要的。应该指出的是calpain-3水解的目的可能不是参与一个降解过程，更可能是一个根据底物的功能不同而在一定程度上进行的不可逆的调节过程7。如在2A型肢带肌营养不良症(LGDM2A)中肌肉营养不良的症状可能是因为肌节重塑失调，这也可以归根于缺乏calpain-3的蛋

7、白水解底物8。很多蛋白在体外实验中被证明可能是calpain-3的底物，但在体内还没有被证明。这些底物包括肌原纤维/Z线蛋白，肌联蛋白(在PEVK区，与N2A线相邻)，肌动蛋白C和肌球蛋白轻链1 等9支持calpain-3在肌节重塑中发挥作用。但有研究发现10，钙蛋白酶抑制蛋白也可以在体外裂解calpain-3，而在体内却暂未发现这种现象，所以那些经过体外验证底物在体内是否也会有相同的作用仍有待验证。最新研究指出11-12，calpain-3的mRNA丰度与蛋白水平表达量间可能是没有相关性的，因此，研究在体内全长度表达的calpain-3，必须通过更多的蛋白水平上的实验，获得其与生理功能相关的

8、数据后才能准确的进行分析。3 骨骼肌特异性蛋白酶的功能和作用 Calpain-3可能在肌肉中修复和维护中起作用13，同时它也被指出参与了肌细胞生成14和细胞凋亡15-16。Calpain-3是肌肉成熟的关键，生理学研究显示17，如果它不存在或不起作用，那么会在人20-40岁时患上2A型肢带肌营养不良症（LGMD2A）。因此，假定与此病相关的钙蛋白酶都被降解和破坏，鉴于人在10岁前不患上LGMD2A，那么calpain-3就不可能是正常肌肉生长所必需的蛋白，确切的来说，它在维护肌肉完整性中有至关重要的作用13。的确，有实验证明18，在肌肉细胞培养中，只有在成肌细胞的增殖和融合后，全长度的calp

9、ain-3才开始表达。另外，在小鼠骨骼肌中缺乏calpain-3和转基因小鼠的calpain-3过量表达两个实验中19-20均不出现明显疾病症状，而肌营养不良症与肌炎（MDM）是一个人类疾病胫骨肌萎缩症和LGMD2J的小鼠模型21，是由calpain-3与N2A在肌联蛋白上的结合位点相邻域的基因突变造成的。在MDM小鼠中，降低calpain-3表达浓度21和小鼠中calpain-3的表达过量22却会导致更严重的肌肉营养不良的疾病症状。根据这些研究结果，有人猜测22，calpain-3的活性可能通过它与肌联蛋白在N2A线的连接位点而被调控，这也许可以合理解释calpain-3转基因动物的健康状况

10、。此外，calpain-3已被证明通过调节核因子IB参与了细胞凋亡16-23。4 骨骼肌特异性蛋白酶与蛋白质降解除了钙蛋白酶系统蛋外白质降解的主要调节途径还有溶酶体途径，线粒体蛋白酶系统，泛素-蛋白酶体途径，胞液蛋白酶水解途径。但Calpains参与肌原纤维蛋白降解却是蛋白质降解过程中的限速步骤，也是家畜屠宰后早期发生肌肉嫩化的主要特征。而肌原纤维蛋白降解的第一步必须是肌原纤维分解成肌丝。肌联蛋白是一个大型的肌节蛋白，主要存在于心肌细胞和骨骼肌细胞中24-25。肌联蛋白的N端锚定在Z线，C端绑定粗肌丝，因此具有维持肌原纤维的完整性和稳定性的功能。同时，肌联蛋白和伴肌动蛋白是N2线的组分，超微结

11、构研究25-26表明N2线是宰后钙蛋白酶最先降解的结构之一。Calpain-3与肌联蛋白紧密结合在一起，且其与N2A线的连接位点有可能能够调节它的活性。同时在体外试验中肌原纤维/Z线蛋白，肌联蛋白等均是calpain-3的底物，虽然尚未被在体内实验中证明。根据这些可以猜测，在calpains参与的肌原纤维蛋白降解过程中，全长度的calpain-3受到钙离子浓度和它与肌联蛋白结合位点的调控，降解成94kDa的活性形态，并参与肌动蛋白降解，促进粗肌丝的释放，从而加速蛋白降解过程，与此同时，Calpains的其它成员也会降解肌原纤维的肌节，释放肌丝并降解为小片段，然后被溶酶体所捕获进一步降解。但肌原

12、纤维在体内是否仍为calpain-3的底物及calpain-3与肌联蛋白结合位点的调控机制不明，因此具体情况仍需要在通过实验来进行验证。5 结语 骨骼肌生长速度最终取决于骨骼肌细胞的数量、肌肉蛋白合成速度和降解速度。激素注射、饲料添加剂的使用、营养状况和饲养管理等都能通过调节以上三个基本因素而影响整体蛋白质的沉积速度，从而影响肌肉生长速度。至今为止，calpain-3已被发现有20余年，仍没有对其生理功能的明确阐述，而国际上对其研究主要集中于它本身的生理结构及其与肌肉运动和营养相关的功能，很少有针对其在肌肉蛋白质降解方面的研究。曾有实验27-28研究通过调整饲料中的蛋白浓度和方法来影响钙蛋白酶

13、的表达量，从而提高肉品质，但主要集中于广泛存在的钙蛋白酶和其内源性抑制剂，对calpain-3的研究却不多。因此，若是能明确calpain-3在蛋白质降解过程中所起的作用并对其调控，从而提高肉品质，必定能够提高畜牧业的生产效益，也会为钙蛋白系统的研究提供大量的科研数据。参考文献1 Rey MA, Davies PL. The protease core of the muscle-specific calpain, p94, undergoes Ca2+-dependent intramolecular autolysisJ, FEBS Lett, 2002, 532: 401406.2 Ga

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