囊胚滋养层细胞活检技术的优势及操作解析

1、曩胚滋养层细胞活检技术的优势及操作解析【引用本文】高英卓，杨大磊，冯迪，等.囊胚滋养层细胞活检技术的优势及操 作解析J .中国实用妇科与产科杂志，2020,36（9）:884-887.作者：高英卓，杨大磊，冯迪，王秀霞，李达1990年Handyside团队首次对携带不同X-连锁隐性遗传病基因的两对夫妇的 胚胎进行了检测，筛选合适的胚胎性别并种植后顺利妊娠。如今植入前遗传学检 测（PGT）技术已广泛应用于全世界的生殖中心并得到了迅速的发展。PGT技术 是指在体外受精-胚胎移植技术的基础上，通过对配子或胚胎进行活检，获取部 分遗传学物质进行染色体和（或）基因学检测，诊断其是否存在单基因缺陷、非 整

2、倍体或染色体拷贝数异常等，选择正常胚胎植入子宫，从而获得健康的子代。 PGT技术的成功实施需要依赖可靠的活检技术获取可用于检测的胚胎遗传物质, 而活检的过程对胚胎而言是一项侵入性的操作活检是否成功将直接影响到PGT 的最终结局。随着分子生物学技术的不断发展,虽然部分检测已经可以使用无创 或微创的方式进行遗传物质的获取，但其检测结果的准确性尚存争议。因此，目 前仍以有创方式获取遗传物质为主,即活检技术。PGT活检技术根据活检时间 可分为极体活检、卵裂球活检与囊胚滋养层细胞活检极体活检是在取卵当天（或 受精后第1天）获取极体用于遗传学检测，可以检测母源性的染色体非整倍体和 易位，但无法检测父源性遗

3、传缺陷；卵裂球活检则是在受精后第3天（68个 细胞阶段），获取1 2个细胞进行遗传学检测；囊胚滋养层细胞活检是在受精后第5天或第6天,胚胎发育至霎胚阶段时，获取510个滋养层细胞用于遗传学检测。1囊胚滋养层细胞活检技术的优势1.1 胚胎损伤小卵裂球活检是从68个细胞中抽取1 2个细胞用于遗传学检 测，而霎胚滋养层细胞活检则是在数百个细胞中抽取5 10个滋养层细胞用于检 测。已有证据表明，卵裂球活检可能会损害胚胎的发育潜能及种植能力。此外, 卵裂球活检时，为了使卵裂球之间连接变得松散，需要利用无Ca2+/Mg2+的 缓冲液处理胚胎，利用时差显微培养系统观察发现这一操作会延迟胚胎致密化和 成霎过程

4、，并降低种植率。滋养层细胞将来会发育成胎盘或胎膜,不直接参与胎 儿形成。因此，滋养层细胞活检可有效避免损伤内细胞团，进而减小活检操作对 胚胎发育的影响。1.2 诊断准确性高霎胚滋养层细胞活检用于遗传学检测的细胞数量（510个） 远多于卵裂球活检（1 2个），提高了诊断准确性，降低了扩增失败的风险。由于滋养层细胞活检技术自身的显著优势以及极体活检和卵裂球活检技术自身 的局限性，结合近些年囊胚培养和囊胚冷冻技术的逐渐成熟，滋养层细胞活检技 术已成为目前应用最为广泛的活检技术。2囊胚滋养层细胞活检技术的操作解析根据活检策略不同，霎胚滋养层细胞活检技术可分为第3天胚胎孵化后活检方案、桑甚胚孵化后活检方

5、案、霎胚当天孵化后活检方案和霎胚即时孵化后活检方黄（图1 ）。第02天A第3天胚胎孵化后活检方案桑甚胚野化后活检方案囊胚当天孵化后活检方案_ 第34天第56天揖旦2©- 辅助孵化。辅扁匕干）徐虫巧） i）昆天0小时第04天囊胚即时孵化后活检方案b有T4期囊胚已应一届人工皱缩L岂未塌陷c 。忘- e5期囊胚厂一卷入I .被缩疗、（花生形）:- W0 B -土:5期囊胚C盘一广（8字形）乙建一 冢人工皱缩晨期囊胚o -宜二接近6期囊胚Y 一 sQ辅助孵化第57天透明带打孔注入培养基修一回 ¥ 一J透一带打孔A 一冷（卜参考4期囊胚活检方案舜> -一参考6期囊胚JT活检方案

6、图1霎胚滋养层细胞活检策略2.1 M3天胚胎孵化后活检方案2004年,de Boer等首次详细阐述了第3天胚 胎孵化后活检方案（图1A ）。胚胎培养至受精后第3天进行辅助孵化，使透明 带形成开口，用来减弱透明带对胚胎的束缚作用，使胚胎更易于孵出。透明带开 口位置应位于透明带与卵裂球之间存在间隙处或碎片处，避免损伤卵裂球。随后 将胚胎继续培养至第5天或第6天，待部分滋养层细胞孵出后进行活检。透明带开口主要有3种方法：化学法、机械法和激光法。化学法是利用酸性台式 液（pH值2.22.6 ）溶解透明带。将装满酸性台式液的显微操作针对准透明带, 通过喷洒台式液溶解透明带，使透明带形成开口。操作动作应熟

7、练迅速,当透明 带形成开口后，立即停止喷洒台式液，避免损伤卵裂球。机械法透明带开口是利 用尖头的显微操作针刺破透明带。胚胎在持卵针固定下，操控显微操作针沿着透 明带切线方向刺破并穿过透明带，随后松开持卵针，借助持卵针和显微操作针之 间的摩擦使透明带开口。机械法操作快捷，然而其开口的大小具有不确定性。激 光法是利用非接触式红外线（1.48pm ）二极管产生的激光，将其对准并击打目 标区域，使透明带形成开口。激光开口的大小和位置可以实现精确控制，且具有 较强的可操作性和重复性，是目前最常用的透明带开口方法。第3天胚胎孵化后活检方案实施起来相对容易，易于掌握，然而其也存在诸多弊 端，例如：在受精后第

8、3天实施辅助孵化后，由于透明带存在开口 ,破坏了囊胚 腔扩张、透明带变薄这一正常发育过程，其对囊胚发育潜能的影响存在争议，有 证据表明，卵裂期激光开口有可能降氐胚胎发育潜能，改变胚胎表观遗传修饰； 囊胚的孵出位置具有不确定性，如果内细胞团孵出，为避免活检损伤内细胞团， 只能等到囊胚完全孵出再进行活检操作；在等待囊胚孵出过程中，需要反复观察 胚胎状态增加了对胚胎发育的干扰如果第3天打孔的卵裂期胚胎未形成霎胚, 那么之前的辅助孵化操作便成为徒劳。2.2 桑甚胚孵化后活检方案桑甚胚孵化后活检方案是指在受精后第4天，以透 明带开口的方式对桑意胚进行辅助孵化，随后胚胎继续培养至第5天或第6天, 待霎胚孵

9、出后，对孵出的滋养层细胞进行活检（图1A ）。与第3天胚胎孵化后 活检方案相比，其优势在于胚胎发生致密化之后，其形成霎胚的概率大大增加， 可以明显减少活检人员实施辅助孵化的胚胎数量。如果胚胎发育速度较快，在取 卵后第4天即可发育至早囊阶段，内细胞团的位置隐约可见，辅助孵化时可以避 开内细胞团。然而,大多数情况下，此方法可能面临内细胞团孵出的风险，目仍 需在培养过程中多次观察胚胎的发育状态。2.3 霎胚当天孵化后活检方案霎胚当天孵化后活检方案是在受精后第5天或第 6天早晨,对霎胚进行辅助孵化（透明带开口），随后将霎胚放回培养箱继续培 养，期间需要反复观察霎胚发育状态，直到霎胚孵出再进行活检（图1

10、A ）。此 方案优点在于：策略相对简单，对活检人员要求较低。然而，由于辅助孵化后， 霎胚孵出所需时间不确定，活检人员需要反复观察霎胚状态，大大增加工作量, 尤其是对于工作量较大的胚胎实验室,显著降低了工作效率。另外，由于各个霎 胚的孵出速度不同，活检人员可能需要分批次进行活检。然而，与第3天/桑意 胚孵化后活检方案相比，第5天或第6天的霎胚可以明确判断内细胞团的位置, 实现有效控制辅助孵化的位置，避开内细胞团。2.4 囊胚即时孵化后活检方案霎胚即时孵化后活检方案是指受精后第5天或第 6天，对完全扩张期霎胚进行透明带打孔，使透明带形成一个狭窄的孔道，随后 立即用活检针沿透明带孔道吸取5 10个滋

11、养层细胞用于遗传学检测（图1BF ）。已有证据表明，霎胚即时孵化后活检方案可取得更好的临床结局，其 霎胚冷冻率、解冻复苏率、临床妊娠率均高于第3天胚胎孵化后活检方案。与霎 胚当天孵化后活检方案相比，霎胚即时孵化后活检方案的优势在于无需提前辅助 孵化，当曩胚发育至完全扩张的4期之后，可以随时在透明带打孔并立即进行活 检，既能简化工作流程，又能节约时间。然而，由于霎胚的发育速度参差不齐， 根据囊胚的不同特征，需要采取不同的活检方法，对活检人员提出了更高的要求。近期，Yang等对不同特征的囊胚活检方法进行了全面、系统地总结，为霎胚即 时孵化后活检方案的广泛应用提供了方法学基础。4期霎胚的活检：首先对

12、霎胚 进行人工皱缩，根据囊胚随后的皱缩状态（塌陷或未塌陷），采用不同的活检方 法。如果人工皱缩后囊胚明显塌陷，在滋养层细胞与透明带剥离处（远离内细胞 团），使用激光进行透明带打孔，利用活检针经孔道吸取5 10个滋养层细胞， 随后将滋养层细胞切割下来（图1B ）。如果囊胚未塌陷,可借助活检针经孔道 向透明带内注入培养基，促使滋养层细胞与透明带剥离，后续操作与塌陷囊胚相 同。5期霎胚根据形态可分为"花生形"和"8字形"。"花生形"霎胚的活检方式：首 先在孵出区域的滋养层细胞连接处用激光击打使其皱缩，待霎胚皱缩回透明带 后，持卵针控制住胚胎

13、，在持卵针对侧的透明带进行人工打孔，经孔道用活检针 吸取滋养层细胞（图1C ）。"8字形"囊胚的活检方法相对简单,可直接吸取孵出 滋养层细胞用于活检，后续操作参考4期霎胚。如果"8字形"囊胚的内细胞团孵 出，先对位于透明带内部的滋养层细胞进行人工皱缩，之后的活检方法可参考4 期霎胚（图1D ）。6期霎胚的活检：直接利用持卵针固定霎胚（避免吸住内细 胞团），利用活检针吸取滋养层细胞。需注意的是，活检之前转移6期囊胚时, 应使用孑堆较大的巴氏德吸管，避免挤压引起霎胚塌陷（图1E ）。一旦霎胚塌 陷，一方面细胞皱缩在一起，滋养层细胞不易被吸进活检针，增加了操作

14、难度； 另一方面，内细胞团与滋养层细胞紧紧包裹在一起，使得内细胞团的位置不易辨 别，有可能在活检过程中误伤内细胞团。另外，对于接近完全孵出的囊胚，即只 有小部分滋养层细胞残留在透明带里，应先将囊胚拽出透明带，随后的活检方法 参考6期囊胚（图1F）。滋养层细胞的切割方法有激光法和机械法:激光法是利用激光击打使滋养层细胞 离断。滋养层细胞被吸进活检针里之后，一边牵拉滋养层细胞，一边用激光击打 细胞，约35次激光击打之后，可离断滋养层细胞；机械法是利用活检针与持 卵针之间的摩擦离断滋养层细胞。滋养层细胞被吸进活检针后，松开持卵针，将 活检针移至持卵针的上缘，迅速向下移动活检针，即可离断滋养层细胞。近

15、期， Yang等提出的"微激光-钝性切割方法"是将激光法与机械法有机结合，活检针吸 取滋养层细胞并向外牵拉使其伸长激光击打位于透明带外缘的滋养层细胞1 2 次，随后利用机械法离断滋养层细胞，1 2次的激光击打有助于后续机械法切 割滋养层细胞（图2 ）。此方法有效减少了激光击打次数，减小了激光带来的热 损伤。图2 "微激光-钝性切割方法”技术要点3囊胚滋养层细胞活检技术的争议无论是通过IVF还是自然受孕，胚胎均可能出现嵌合体。嵌合体是指胚胎包含2 种及以上的遗传学不同的细胞系，文献报道的嵌合体发生率从30%90%不等。 各个IVF实验室嵌合体发生率的差异受多个因素的影响，例如遗传学检测技术、 非整倍体的界定标准、活检取材部位的选择以及实验室培养环境等。因此,关于 囊胚滋养层细胞活检可靠性的争议，主要在于滋养层细胞的核型是否可以代表内 细胞团的核型。诸多研究讨论了滋养层细胞活检和内细胞团活检诊断一致性的问 题，诊断一致率为96.1%100%。就目前的发展现状来说，囊胚滋养层细胞活 检仍是最可靠的遗传学检测方法。另外，霎胚滋养层细胞活检技术的争议还包括 部分PGT治疗周期患者可能由于无囊胚形成而取消