多重聚合酶链反应用于D－K型沙眼衣原体基因分型的研究

1、多重聚合酶链反应用于DK型沙眼衣原体基因分型的研究【摘要】目的摸索一套泌尿生殖道沙眼衣原体基因分型的多重聚合酶链反应法。方法选择某一型与其它各型均不同的可变区部位作为下游引物，以恒定区1区的高度保守区作为各型的公用上游引物，优化反应条件，进行标准株和临床野生株的多重聚合酶链反应扩增，并与聚合酶链反应限制性内切酶片段多态性方法比较。结果用摸索出的反应系统和条件，对8个标准株进行扩增，扩增出与理论值一致的片段，并可直接在普通水平琼脂糖凝胶进行电泳。特异性检测证明：衣原体各型之间没有非特异性交叉扩增，对泌尿生殖道病原和寄生微生物进行扩增，未扩出任何DNA带。对临床野生株分型结果证明：复合聚合酶链反应

2、阳性率为100，而聚合酶链反应限制性内切酶片段多态性为94.44。结论本套衣原体基因分型的多重聚合酶链反应法特异、敏感、快速、实用，最终能用于临床分型。【关键词】衣原体，沙眼聚合酶链反应基因型Genotyping of Chlamydia trachomatis Isolates by a Multiplex PCRLIU Quanzhong, CHEN Jinying, JIAO Wenling, et al.(Tianjin Institute of Sexually Transmitted Diseases. Tianjin 300052)【 Abstract】 Objective To

3、 establish a multiplex PCR genotyping method for Chlamydia trachomatis isolates. Methods With the aid of the special gene software, the homogenicity of C.trachomatis D K omp1 gene was analysed, and the primers for genotyping were designed accordingly. The differences of amplified products of each ge

4、notype were over 80 bp so that they could be distinguished on agarose gel electrophoresis. The multiplex PCR was applied to test the reference and wild strains and was compared with PCR RFLP method. Results After repeated experiments, each reference strain was amplified to reveal a clear band by the

5、 multiplex PCR which could be differentiated with each other on agarose gel electrophoresis. All wild strains could be genotyped by the multiplex PCR while 94.44 of the strains could be genotyped by PCR RFLP. Conclusion The multiplex PCR genotyping method for C.trachomatis is a sensitive, specific,

6、convenient and practical tool for clinical application.【 Key words】 Chlamydia trachomatis Polymerase chain reaction Genotype沙眼衣原体(Ct)是非淋菌性尿道炎(NGU)的主要致病菌，部分可引起附睾炎、前列腺炎、输卵管炎、盆腔炎、感染后不孕等严重并发症，但约50的男性、70的女性患者临床无症状或症状很轻微1。这些不同状态与衣原体不同型的致病性有关。由于目前的分型方法均难以用于临床，迄今缺乏Ct大规模临床分子流行病学调查，难以确定不同型与所致疾病的关系。我们拟摸索一套特异、实

7、用的泌尿生殖道沙眼衣原体基因分型的多重聚合酶链反应法。材料和方法一、标本来源(一)标准株：18个标准株中，15个Ct血清型标准株由加拿大Sherbrooke大学Frost博士惠赠：AG17/OT、BTW5/OT；CTW3/OT；DUW3/CX；EUW5/Cx；FUW55/Ur；GUW57/Ur；HUW4/Cx；IUW12/u；JUW36/Cx；KATCCVR887；L1LiCM440，L2LLCM434/Bu；L3LLCM404，TE55/C由中国科学院薛庆富研究员提供。Ba/Ap2由荷兰Free大学的LanJar博士提供。L2/434/Bu、E/NS1由协和医院病毒室倪安平博士提供。(二)临

8、床野生株:36份已被细胞培养法证实为Ct阳性的标本,来源于我所临床诊断为NGU患者的尿道或宫颈拭子标本,男26例,女10例,年龄1839岁。二、方法(一)临床标本采集:用文献2的方法。(二)细胞培养:用文献3的方法。(三)标本处理:50L标准株或临床野生株培养液，离心沉淀后，加裂解液（50mmol/LKCl,2.5mmol/LMgCl2,10mmol/LTrisHClpH8.3,0.1g/L明胶，0.45NP40,0.45吐温20，蛋白酶K200mg/L）20L,6515min，9510min。染色体DNA按文献4抽提。(四)PCR限制性酶切长度多态性分析(PCRRFLP)分型：按Frost等

9、报道5设计引物,序列为：outer1,5ATGAAAAAACTCTTGAAATCGG3，outer2序列为5TTTCTAGA(T/C)TTCAT(T/C)TTGTT3，由日本大连宝生物有限公司合成。扩增片段长度为1077bp。反应体系：10反应缓冲液5L、dNTPs5L（各200mol/L）、上下游引物各0.3mol/L、Taq酶1U、模板DNA510L、去离子水20L。模板DNA,每株5L。反应条件及产物的酶切电泳参考文献6,但染液为0.5g/mL浓度的溴化乙锭。(五)多重PCR分型：1.引物设计：选择某一型与其它各型均不同的部位作为下游引物，而以恒定区1区的高度保守区作为各亚型扩增公用的上

10、游引物，用金钥匙扫描程序证明各引物特异，用引物报告筛选中符合引物条件。检测9条引物之间有无互补、或存在发夹结构、二聚体,亚型的扩增片段大小。互相之间差别要80bp，经筛查和精选，选出的引物见表1。2.扩增系统:10mmol/LTrisHCl(pH8.3),50mmol/LKCl,2.5mmol/LMgCl2,dNTPs0.3mmol/L,引物：上游0.6mol/L,下游各0.3mol/L,Taq酶0.5U,模板DNA40ng,双蒸水加至25L。扩增条件：94预变性300s后,94变性45s,60退火45s,72延伸60s,30个循环后,72延伸600s。扩增产物取5L于2琼脂糖凝胶（含溴化乙锭

11、0.5g/L）电泳，在紫外线灯下观察结果。结果一、omp1扩增1.标准株:17个标准株样品均扩增出1条1077bp的预期扩增片段。见1。2.野生株:36个经DNA抽提的标本有34个扩增出预期的1077bp的片段。二、基因分型1.PCRRFLP基因分型：8个标准株RFLP分型结果见2。2.复合PCR基因分型：对标准株的扩增：用上述反应系统和条件，对标准株进行特异性扩增，扩增出与理论值一致的片段。见3。对引物特异性检测：衣原体各型之间没有非特异性扩增。我们对泌尿生殖道病原微生物和寄生微生物：大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、链球菌、八叠球菌、乳

12、酸杆菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌、醋酸钙不动杆菌、嗜麦芽窄食单孢菌、淋球菌、阴道加德钠菌、解脲支原体共18种(来自我院细菌室及我所实验室，已经培养分离鉴定)进行扩增，未扩出任何DNA带。三、两种方法的比较1.标准株:8个标准株两种方法检测出相应的Ct阳性结果。2.野生株:复合PCR基因分型:对36株野生株标本全部扩增出与相应的标准株相对应的阳性带，有2份为混合型，鉴定结果:E:14株，F:8株，D:5株，G:3株，J:2株，H:2株，F/E混合:2株，阳性率100。PCRRFLP:36株野生株标本扩增出34份阳性的omp1带。进行酶切片段长度多态性分析，有32份与相应的标准株相对应，推断为该型，有

13、2份难以判定属于哪一型，按已有的方法应判为混合型，但难以进一步判断是哪两型的混合。鉴定结果:E:13株，F:8株，D:4株，G:3株，J:2株，H:2株，混合:2株，阳性率为94.44。同一标本复合PCR法与PCRRFLP法分型结果相同。表1沙眼衣原体D-K型复合PCR的引物序列引物种类引物预期扩增片段上游共用引用5-CCGACCGCGTGTGAAAACAGATGT-3下游引物D型5-GTAAGATCAAGAGGCAATTCTTT-3547bpE型5-TCCTTAAGGTATCCGCTAGA-3235bpF型5-CAATTGCAGTTAGCTCCAGC-39344bpG型5-CTCCGTTGT

14、TGGATCGTTGA-3100bpH型5-CGACGTCAAGTGGAAATTCCG-3514bpI型5-TCAGCCAGTTCGTTGGTTTTCTTT-3819bpJ型5-TCAGCCAGGTGGTTATCGTT-3721bpK型5-TAGGCTGAGGATACCCATCG-3674bp 讨论 血清学分型虽然建立较早，但所用标本应是纯Ct，需要细胞培养，分离、连续传代。大约有4280的分离株可在传代中丢失，另外需一大组单克隆抗体(McAb)，而McAb很难获得，并未商品化，难以广泛应用。因此血清学分型一直停留在少数实验室的研究水平上。近年来基因研究的进展使得Ct的分型达到了新的水平，这些

15、方法包括PCRRFLP、可变区测序、全染色体基因分型、RAPD以及SSCP等，其中PCRRFLP方法因不需作细胞培养，2d可完成一批临床标本的分型，可用于临床而倍受推崇，被国内外的一些实验室所采纳6,7，被认为是最有前途广泛应用于临床的分型方法。从本文结果可以看出，用PCRRFLP分型，与标准株对比，大部分野生株可以鉴定其型别，有一些则比较含糊，如2例混合感染的形。可能是由于Ct型之间同源性很高，酶切后，Ct各型之间的片段相同的很多，不同的很少,当有混合感染，那些微小区别进一步减少，结果难以判断。118个标准株ompl基因扩增结果（M：PCR Marker）2沙眼衣原体D-K型ompl基因RC

16、R-RFLP分型结果3沙眼衣原体D-K型 多重PCR基因分型结果我们在计算机辅助下设计DK这8个型的引物时，选择某一型与其它各型均不同的部位作为下游引物，而以恒定区1区的高度保守区作为各型扩增公用的上游引物，这样既保证了不同型扩增的特异性，又保证了所扩增出来的片段只是衣原体omp1基因上的，保证了分型的高度特异，用金钥匙扫描程序证明各引物特异，用引物报告筛选中符合引物条件。另一方面，减少了7条引物，这就极大地减少了引物之间的干扰和互补。引物确定后,我们先以一定的反应系统优化反应条件，当反应条件优化确定后又反回来优化反应系统的一些成分的浓度，优化好反应系统后，再试验已确定的反应条件是否适应新的反

17、应系统，如此多次反复，才确定适应于本套复合PCR的最佳反应系统和扩增条件。其中最主要的优化变量是Mg?浓度和退火温度。虽然引物的退火温度在某种程度上是可以计算的，但以我们的结果所示，一方面很多的引物对难以有一个统一的退火温度点；另一方面，即使经过平衡找到某一温度，也须经反复试验来摸索更合适的退火温度，因为多重PCR的条件几乎必然要凭经验修改8。由于本实验的退火温度较高，敏感性在加入临床标本时有所降低，我们除调整Taq酶、加Taq酶前煮沸外，还加了增强剂25二甲基亚砜（DMSO）在特异性和产物产量的敏感性上有所改善。本文结果显示：Ct分型PCRRFLP的敏感性低于复合PCR，原因尚不完全清楚。一

18、方面由于酶切需要足够量的PCR扩增产物，反应体积通常在50100L，而较大体积的样品加热和冷却的效率不如小体积高。另一方面，PCR反应的长度对扩增效率有影响，模板给予长PCR产物的信号弱于给予短PCR产物的信号。最佳是在250750bp之间，过长或过短扩增效率都可能下降,本文复合PCR绝大多数片段都在最佳范围内,而PCRRFLP则为1077bp。刘全中（天津性传播疾病研究所300052）陈锦英（天津性传播疾病研究所300052）缴稳苓（天津性传播疾病研究所300052）田静群（天津性传播疾病研究所300052）傅志宜（天津性传播疾病研究所300052）参考文献1，Hillis S,Black

19、C,Newhall J,et al.New opportunities for Chlamydia prevention: applications of science to public health practice. Sex Trans Dis,1995,22:197 202.2， Pozniak A.Sexually transmitted diseases and urinary tract infections.Curr Opin Infect Dis, 1999,12:33 34.4， Frost EH, Deslandes S, Bourgaux Ramoisy D.Chlamydia