大鼠实验性短暂脑缺血血浆中cAMP相对浓度与血脑屏障变化之关系

1、大鼠实验性短暂脑缺血血浆中cAMP相对浓度与血脑屏障变化之关系摘要目的观察短暂脑缺血再灌流过程中血脑屏障超微结构及血浆中环腺苷酸(cAMP)相对浓度的变化。方法用改良pulsinelli法造成短暂脑缺血再灌流模型。用H3-cAMP放免分析药盒测定血浆中cAMP相对浓度，并观察血脑屏障中紧密连接的变化。结果在短暂缺血及再灌流早期，血浆中cAMP相对浓度及紧密连接紧密程度(闭锁小带长度、凸嵴数目)无明显变化，血管内皮中胞饮小泡数目明显增多。再灌注中期内皮细胞间紧密连接松弛，闭锁小带长度及凸嵴数目均减少。血浆中cAMP浓度亦降低。结论短暂脑缺血及再灌流早期血脑屏障通透性的改变，主要是由于内皮细胞中胞

2、饮小泡数增多所致。血浆中cAMP相对浓度可以反映血脑屏障的开放程度。关键词脑缺血及再灌注环腺苷酸血脑屏障 The relationship between the change of blood-brain barrier ultrastructure and the relative concentration of plasma cAMP in rat expreimental transient cerebral ischemia.Jia Dong,Gao Guodong.Department of Neurosurgery,The Second Hospital of the Fort

3、h Military University,Xian 710038.AbstractObjectiveTo observe the change of blood-brain barrier ultrastructure and relative concentration of plasma cAMP in rat experimental transient cerebral ischemia.MethodsUsing radio-immunoassay technique investigated the relative concentration of cAMP in rat pla

4、sma after transient cerebral ischemia and reperfusion,using routine electron microscopy observe the change of blood-brain barrier tight junction.ResultsIn transient cerebral ischemia and early reperfusion groups.The relative concentration of plasma cAMP didn，t change significantly more than sham-ope

5、rated groups,So did the tight junction.but the number of plasma vesicle was more than sham-operated grouds and early reperfusion groups.With the time of reperfusion,the tight degree of tight junction became looser and looser.At same time,the relative concentration of cAMP in palsma became lower and

6、lower.ConclusionIn transient cerebral ischemia and early reperfusion,the reason of blood-brain barrier opening was the addition of plasma vesicle in brain capillary endothelial cell.Key wordReperfusion following cerebral ischemiaCerebra ischemiacAMPBlood-brain barrier.血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)是中

7、枢神经系统和血液的分界面。脑缺血及再灌流过程血脑屏障的通透性会发生改变。而血脑屏障的完整性主要依靠血管内皮细胞之间的紧密连接，其次血管内皮细胞中胞饮小泡数目少也是其屏障的结构基础。内皮细胞间紧密连接紧密程度可以通过紧密连接闭锁小带的长度及凸嵴数目这两种指标进行衡量1。本实验试通过对实验性短暂脑缺血大鼠血浆中cAMP相对浓度及血脑屏障中内皮细胞紧密连接程度、胞浆中胞饮小泡密度值变化的观察，来探讨血浆中cAMP相对浓度与血脑屏障通透性变化的关系及可能的机理。1材料与方法1.1动物模型及分组正常雄性近交系SD大鼠，由本校实验动物中心提供，体重200250g，共35只，分为7组，每组5只，设假手术组；

8、缺血10min组,缺血10min再灌流0.5h、1h、6h、24h、72h组。缺血方式：采取改良式pulsinelli法2制作大鼠缺血及再灌流模型。1.2试剂H3-cAMP放免分析试剂盒(灵敏度高于0.01pmol)，中国原子能研究院产品。1.3动物血浆标本采集、处理及cAMP测定按参考文献中方法。1.4电镜标本制备处死动物后立即分离海马区，按常规方法制备电镜标本，切成1m大小的小块，投入3%戊二醛固定，环氧树脂包埋，超薄切片，硝酸铅和醋酸钠双染色。日立H-800透镜下观察脑血管内皮细胞中胞饮小泡的数目、紧密连接闭锁小带长度及凸嵴数目，并按参考文献4计算胞饮小泡数密度值。1.5统计方法以均数标

9、准差表达实验结果，t检验分析各组间差异，并进行相关分析。2结果各组血浆中cAMP相对浓度、血管内皮间紧密连接长度与凸嵴数目的和及胞饮小泡数密度值见表1。表1血浆中cAMP相对浓度测定等结果(s)血浆中cAMP相闭锁小带长度胞饮小泡数对浓度(nmol/L)+凸嵴数目密度值(1/m3)假手术组缺血10min组再灌流0.5h组再灌流1h组再灌流6h组再灌流24h组再灌流72h组92.045.389.340.285.636.846.733.340.835.244.534.5778.436.59122.110.3118.3118109.512.375.613.568.714.670.315.690.41

10、4.80.530.091.040.120.980.140.650.080.620.080.700.030.690.10缺血10min再灌流1h、6h、24h组时，cAMP相对浓度与其它各组有显著差异(P0.05)，其cAMP值明显低于其它各组。与此同时，这几组内皮细胞中紧密连接闭锁小带与凸嵴数目也明显低于其它各组P0.05)。而内皮细胞中吞饮小泡数密度值则是在缺血10min组及缺血10min再灌流1/2h时比其它组显著增多(P0.05)。采用线性相关分析发现缺血10min再灌流1h、6h、24h时血浆中cAMP的相对浓度与血管内皮细胞紧密连接闭锁小带长度、凸嵴数目有一定的正相关关系。 3讨论血

11、脑屏障作为血液与中枢神经系统的分界面 ，其主要结构就是血管内皮细胞之间的紧密连接，其次内皮细胞胞浆中胞饮小泡数目少也是其屏障的基础。血脑屏障的开放通常是通过以下3种途径：(1)内皮细胞间紧密连接的开放。(2)内皮细胞胞浆中胞饮小泡数目增多。(3)细胞本身细胞质通道开放5。因此血脑屏障的紧密程度可以用紧密连接闭锁小带的长度、凸嵴的数目和胞饮小泡数目多少来衡量。我们发现在短暂脑缺血及再灌流早期，管周间隙及星形胶质细胞的足突出现增大、肿胀，血管内皮细胞中胞饮小泡数目较手术对照组明显增加，细胞间紧密连接闭锁小带长度、凸嵴数目无明显变化，血浆中cAMP相对浓度则保持相对稳定。随着再灌流时间延长至1h24

12、h，星形胶质细胞足突及管周间隙进一步肿胀、扩大，细胞间紧密连接闭锁小带长度、凸嵴数目开始逐渐减小、减少。血浆中cAMP相对浓度亦相应降低。此时内皮细胞中胞饮小泡数目较假手术组略有增多，但无显著差异。在灌流72h时，星形胶质细胞足突肿胀及管周间隙大小明显减轻或缩小，内皮细胞间紧密连接闭锁小带长度、凸嵴数目较再灌流1h24h组明显增大，血浆中cAMP相对浓度较上述组明显升高，内皮细胞中胞饮小泡的数目较上述组无明显差别。通过这样的结果，我们可以认为在短暂脑缺血及再灌流早期，血脑屏障的通透性增高主要是通过胞饮小泡数目增多来实现的，细胞间紧密连接此时未开放，血浆中cAMP相对浓度保持相对稳定。随着再灌流

13、时间的延长，紧密连接开始松弛，血浆中cAMP相对浓度则相应降低，因此血浆中cAMP浓度在短暂脑缺血再灌流一定时间内能够反映血管内皮细胞间紧密连接的紧密程度。到了脑水肿恢复期，紧密连接紧密程度增高，血浆中cAMP相对浓度亦相应增高，这时脑的轻微水肿则主要是由于胞饮小泡数目异常所致。cAMP是细胞内重要的信息分子，它参与体内许多重要的代谢及信号转导过程，血浆中的cAMP浓度可以间接反映出细胞内cAMP的浓度。作为第二信使的cAMP，其影响血脑屏障的原因是对星形胶质细胞维持及诱导BBB完整性的功能具有协同作用。其作用的机制可能是在于磷酸激酶A(PKA)介导的磷酸化，如用拮抗剂拮抗PKA磷酸化，增加细

14、胞内cAMP浓度不再协同星形胶质细胞诱导维持内皮细胞BBB的完整性。增加细胞内cAMP的浓度，对内皮细胞的吞饮小泡数密度值几乎无影响。高浓度的cAMP能够维持磷酸化，调节细胞骨架结构(纤维肌动蛋白、E-钙粘附蛋白)以及ZO-1蛋白，使紧密连接接受蛋白磷酸化调控，增加了紧密连接程度，协同增强了BBB的完整性。作者单位：710038西安 第四军医大学唐都医院神经外科参考文献1 Laterra J,Guerin C,Coldstein GW.Astrocytes induce neural microvascular cells to form capillary-like structures in vitro.J Cell Physiol,1990,144:204.2 李露斯，黎红华，郑彩梅.MK-801对缺血性脑损伤线粒体呼吸功能疗效的研究.第三军医大学学报，1994，16：239.3 杨玉，屠文俊，殷凯生，等.特非那丁对豚鼠血浆cAMP相对浓度的影响.南京医科大学学报，1996，16(5)：446.4 李玲，黄如训，苏镇培.局部脑梗塞再灌流边缘区血脑屏障超微结构变化.中风与神经疾病杂志，1998，15(1)：11.5 Wolbu