LC_MS_MS法测定人血浆中多潘立酮的浓度_余鹏

1、论著LC MS /MS 法测定人血浆中多潘立酮的浓度12323311余鹏，阳国平，冉黎灵，谭鸿毅，范志宏，刘智，金亚超，程泽能*（1中南大学药学院，长沙410013；2中南大学湘雅三医院，长沙410013；3湖南泰格湘雅药物研究有限公司，长沙410013）摘要目的：建立人血浆中多潘立酮浓度的LC MS /MS测定法，用于临床试验中多潘立酮血药浓度的测试。方法：以泮托拉15唑为内标，血浆样本经0. 1mol ·L 氢氧化钠溶液碱化后用乙醚萃取处理。采用Agilent TC C 18色谱柱（4. 6mm 150mm ，1Phenomenex Gemini C 18柱（4mm 3. 0mm

2、 ，10m ）为保护柱，v /v）m ）为分析柱，以甲醇20mmol ·L 甲酸铵水溶液（70 30，为流动相，使用电喷雾离子源（ESI ），以正离子多反应监测（MRM ）方式进行检测。结果：每个样本分析时间为5min 。血浆中11内源性物质对测定无干扰，多潘立酮线性范围为0. 6970 44. 60g ·L ，定量下限（LLOQ ）为0. 6970g ·L 。日内、日间多潘立酮与内标的平均提取回收率分别为100. 7%和98. 7%，平均基质效应分别为为101. 4%和精密度（RSD ）均小于10%，98. 9%，且均不存在浓度依赖性。结论：本方法特异性强，灵敏

3、度高，测定结果可靠，适用于临床试验中血浆样本的高通量分析。关键词：多潘立酮；血药浓度；液相色谱串联质谱中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：02541793（2011）04061906LC MS /MS determination of domperidone in human plasmaYU Peng 1，YANG Guo ping 2，RAN Li ling 3，TAN Hong yi 2，FAN Zhi hong 3，LIU Zhi 3，JIN Ya chao 1，CHENG Ze neng 1*（1School of Pharmaceutical Science ，Centra

4、l South University ，Changsha 410013，China ；2Third Xiangya Hospital ，Central South University ，Changsha 410013，China ；3Hunan Tiger Xiangya Drug RDCo，Ltd，Changsha 410013，China ）Abstract Objective ：To establish an LC MS /MSmethod for the determination of domperidone in human plas-and to assay the biolo

5、gical samples from clinical trialsMehods ：Pantoprazole was used as internal standardAl-ma ，kalified by 0. 1mol ·L 1sodium hydroxide solution ，plasma samples were extracted with ethyl etherThe extractive was separated on an Agilent TC C 18column （4. 6mm 150mm ，5m ）guarded by a Phenomenex Gemini

6、C 18col-umn （4mm 3. 0mm ，10m ）The mobile phase consisted of methanol 20mmol ·L 1ammonium formate （70 30，v /v）Electrospray ionization （ESI ）source was applied and operated in the positive multiple reaction monitoring （MRM ）modeResults ：Each analysis was completed within 5minChromatograms showed

7、no endogenous interfer-ing peaks with blank samplesThe linear calibration curve was obtained over the concentration on range of 0. 697044. 60g ·L 1The limit of quantification was 0. 6970g ·L 1The inter and intra day precision （RSD ）was less than 10%The average extraction recovery of domper

8、idone and pantorazole was respectively 100. 7%and 98. 7%，and the average matrix effects of of domperidone and pantorazole were respectively 101. 4%and 98. 9%，in which no concentration dependences were observedConclusion ：The method is specific ，sensitive and accuracy ，and proved to be suitable for t

9、he determination of domperidone in human plasma in clinical plasma samplesKey words ：domperidone ；plasma drug concentration ；LC MS /MS多潘立酮（domperidone ）是一种多巴胺2（DA2）受体拮抗剂，它作用于血脑屏障外的化学受*通讯作者体触发区，发挥其抗呕吐作用。由于DA2受体也同样存在于胃肠道，因此多潘立酮作为DA2受体拮抗Tel ：（0731）82650446；E mail ：chengzenengcsuyahoocn剂可减少多巴胺介导的胃平滑肌松弛。

10、在胃肠道中，多潘立酮作为一种促动力药，能增加消化道的动力。多潘立酮不易透过血脑屏障而进入大脑，罕见1有中枢神经系统不良反应发生。多潘立酮血药浓度的测定方法在国内外文献中已有不少报道。早期曾采用兔体内提取的抗体，进行放免法分析，但该法线性范围较窄（0. 2 10. 051g ·L ），选择性相对较差，易受代谢产物干扰，且有放射性污染2甲醇与甲酸铵（色谱纯）购自美国Tedia 公司；实验用水为实验室自制去离子超纯水，其他试剂（分析纯）均购自国药集团化学试剂有限公司。实验中所使用的空白血浆均采集自健康中国志愿者。2色谱/质谱条件2. 1色谱条件色谱柱：Agilent TC C 18（4.

11、6mm 150mm ，5m ）；保护柱：Phenomenex Gemini C 18（4mm 3. 0mm ，10m ）；流动相：甲醇20mmoL ·L 1甲酸铵水溶液（70 30，v /v）；流速：1mL ·min 1；柱温：30 ；进样量：5L 。柱后流出液的1/5分流进入到质谱仪检测。质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI ），正离子MRM 模式检测。多潘立酮：监测离子m /z426. 3175. 1，碎裂电压为180V ，碰撞能量为27eV 。内标碎裂电压为120泮托拉唑：监测m /z384. 2200. 2，V ，碰撞能量为6eV 。离子源参数设置如下：Gas 300

12、 ；Gas Flow ，8L ·min 1；Nebulizer ，0. 2Temp ，MPa ；Capilary ，4. 0kV 。33. 1对照品溶液与对照品血浆的配制对照品储备溶液精密称取多潘立酮对照品11. 15mg ，置于10mL 量瓶中，以少量甲醇溶解后，加甲醇至刻度，摇匀，即得含多潘立酮浓度为1. 115g ·L 1的对照品储备溶液，置于4 冰箱保存。3. 2内标溶液精密称取泮托拉唑对照品10. 05mg ，置于10mL 量瓶中，用少量甲醇溶解后，加甲醇1至刻度，摇匀，即得浓度为1. 005g ·L 的泮托拉唑内标储备溶液，置于4 冰箱保存。临用前将内

13、标1储备溶液用甲醇稀释成浓度为40. 00g ·L 的内标溶液。之后，高效液相色谱法大量应用到多潘立酮的体内药物分析中，经文献报道的有5HPLC UV 法3、HPLC FLD 法4，等。当多潘立酮给药剂量为20mg 时，由于其首过作用明显，生物1利用度低，血浆中药物浓度低至约1g ·L ，之前报道的HPLC UV 法无法达到要求的灵敏度。虽然HPLC FLD 法灵敏度能满足要求，但该法对样本处理要求较高，且测定比较费时（每次分析约10min ），不适合大量样本的分析。近年来，随着LC MS 仪器的日益普及，其在多6，7。但在潘立酮体内药物分析中的应用也有报道有些LC MS

14、测定法涉及到中国受试者的文献中，在色谱分离中，多潘立酮的容量片面追求分析速度，8，9；而有些报道还是与蛋白因子（k ' ）甚至不到1. 010质沉淀的样本处理方法相搭配。这些方法中，多潘立酮与各种内源性杂质的色谱分离很不完全，而报道中的方法学考察内容却未涉及基质效应的影响。本实验室在方法建立过程中，注意到保留时间较小时，基质效应的影响不可忽略。为此，本文重新优化了LC MS /MS测定方法中的各种条件，并对方法进行了充分的方法学验证，并将新方法成功应用于临床试验样本的测试。1仪器与试药Agilent 6410B 型三级四极杆液质联用仪，配有3. 3取多潘立酮浓度为1. 115g

15、83;L 1的对照品储备溶液，用流动相逐级稀释，即得含对照品血浆自动进样器、液相色谱仪、柱温箱、电喷雾电离离子源（ESI ）及Agilent MassHunter Workstation Software 数据处理系统（Agilent ，美国）；METTLER TOLEDO AB135S 十万分之一天平（梅特勒，瑞士）；XW 80A 涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂）；TGL16M 型冷冻离心机（长沙英泰仪器有限公司）；MTN 2800D 氮吹仪（AUTO SCIENCE 公司）；AHL 2001P 型实验室纯水系统（艾科浦，重庆颐洋企业发展有限公司）。多潘立酮对照品（批号10030420050

16、2）购自中国药品生物制品检定所；内标泮托拉唑对照品（批号20080509）由株洲金泰药业有限公司提供。223. 0，111. 5，55. 75，多潘立酮浓度分别为446. 0，27. 88，13. 94，6. 970g ·L 1的系列对照品溶液。分别精密吸取上述系列对照品溶液50L ，置于10mL 尖底玻璃试管中，在40 微弱氮气流下吹干后，精密加入500L 空白血浆，涡旋混匀30s ，即可得22. 30，11. 15，到含多潘立酮浓度分别为44. 60，5. 575，2. 788，1. 394，0. 6970g ·L 1浓度级别的系列对照品血浆。4血浆样本处理精密吸取含药

17、血浆500L ，置于10mL 尖底玻1璃试管中，精密加入内标溶液（40. 00g ·L ）501L ，加入0. 1mol ·L 氢氧化钠水溶液50L 后，涡旋混匀30s ，加入乙醚4mL ，涡旋振荡3min ，离40 水心（440g 5min ），取上层有机溶剂3mL ，浴中微弱氮气流挥干，残渣以200L 流动相复溶后，吸取5L 进样到色谱系统分析。55. 1方法学考察特异性在优化后的色谱/质谱条件下，多潘立酮及内标泮托拉唑的质谱见图1 。图1Fig 1（B ）多潘立酮（A ）与内标泮托拉唑（B ）的质谱图Typical MRM mass spectras of dompe

18、ridone （A ）and pantoprazole图2Fig 2sampleA空白血浆（blank plasma ）B多潘立酮浓度0. 6970g ·L 1C受试者服用600（blank plasma spiked level of domperidone ）血浆administration of 600mg domperidone tablets ）典型血浆色谱图Typical MRM chromatograms for domperidone in human plasma空白血浆、对照品血浆和受试者血浆的典型色谱图见图2。多潘立酮和内标泮托拉唑的保留时间分别为4. 6和3.

19、 7min ，峰形良好，血浆中内源性物质不干扰多潘立酮和内标的测定。5. 2按照“3. 3”项下方法配制不同浓度级别的系列对照品血浆。加入内标标准曲线与最低定量限1mg 药物后3h 血浆（plasma sample from a volunteer 3h after single oral溶液（40. 00g ·L ）50L 后，按“4”项下方法处理后进行分析，记录多潘立酮与内标泮托拉唑色谱峰面积。以多潘立酮峰面积与内标泮托拉唑峰面积的比值（Y ）为纵坐标，以多潘立酮在血浆样本中的浓度（X ）为横坐标进行线性回归（权重为1/X ），得到多潘立酮的直线回归方程为：Y =0. 6882X

20、 +0. 0251r =0. 99781结果表明多潘立酮浓度在0. 6970 44. 60g ·L 范围内线性关系良好。最低定量限0. 6970g ·2L 1浓度水平上，5份样本的精密度RSD 为8. 9%，准确度为92. 1%。5. 3精密度与准确度取洁净的10mL 玻璃离心“3. 3”试管，按照项下所述方法，分别配制含多潘立酮11. 15，35. 68g ·L 13个浓度的浓度分别为1. 394，“4”项下方法试验，在不同天的质控血浆样本。按照时间内连续制备并测定3个分析批，每批样本分为低、中、高3个浓度水平，每个浓度进行5样本分析，计算日内和日间精密度、准确

21、度，数据见表1。表1精密度、准确度、提取回收率与基质效应实验结果（ s ）Precision ，accuracy ，recovery and matrix effects of domperidone in human plasma日内（intra day ）测得浓度（found ）/g ·L 11. 344 0. 12310. 49 0. 3533. 13 2. 44RSD /%9. 23. 47. 4准确度（accuracy ）/%96. 494. 192. 9日间精密度（inter day ）测得浓度（found ）/g ·L 11. 407 0. 11411. 31

22、 0. 8534. 19 2. 54RSD /%8. 17. 57. 4准确度（accuracy ）/%100. 9101. 495. 8提取回收率（extraction recovery ）/%99. 2 9. 3103. 1 3. 499. 8 6. 1基质效应（matrix effects ）/%102. 2 4. 3106. 5 3. 695. 5 3. 2Tab 1C /g ·L 11. 39411. 1535. 685. 4提取回收率和基质效应取洁净的10mL 玻璃离心试管，按照前述方法配制含多潘立酮低、中、冻融循环后的稳定性；将质控血浆样本于40 条15，30d 后将样

23、本取出，件下冻存0，室温下自然解冻，放置至室温后，按“4”项下所述方法处理后进样，考察血浆样本在40 条件下存放30d 的稳定性。结果，在上述稳定性考察条件下，多潘立酮的浓度均保持稳定，未出现明显变化（测得值与标示值的偏差均小于10%）。6应用本文所建立的多潘立酮血药浓度测试方法已成功应用于20名健康受试者中进行的一项生物等效性研究。20名男性健康志愿者在试验前进行病史询问和体格检查（包括心电图、胸透、肝功、肾功、血常规、尿常规和乙肝表面抗原检查等），在被告知试验目的、药物特性、可能出现的药物不良反应、受试者与试验者的权益和义务的前提下，签署知情同意书。入选受试者年龄为（24 4）岁，体重均大

24、于50kg ，2BMI =体体重指数（BMI ）在19 24kg ·m 之间22，重（kg ）/身高（m ）同批体重相差不超过 15%。采用随机、开放、双周期交叉试验设计。20例11. 15，35. 68g ·L 1）3个浓度的质控高（1. 394，血浆样本，每个浓度平行制备5份，按照“4”项下方法处理后进样到色谱系统分析，记录多潘立酮的峰面积（A 1）和内标的峰面积（B 1）。另取洁净的10mL 玻璃离心试管数支，加入含多潘立酮低、中、高（13. 94，111. 5，356. 8g ·L 1）3个浓度的对照品1再分别加入内标溶液（40. 00g ·L

25、）溶液50L ，50L ，40 水浴微弱氮气流挥干，200L 流动相复取5L 进样到色谱系统分析，记录多潘立酮溶后，的色谱峰面积（A 2）和内标的色谱峰面积（B 2）。再取洁净的10mL 玻璃离心试管数支，分别加入含多111. 5，356. 8g ·L 1）3潘立酮低、中、高（13. 94，个浓度的对照品溶液50L 和内标工作溶液（40. 00140 水浴微弱氮气流挥干，g ·L ）50L ，残渣用“4”空白血浆样本按项下方法处理后得到的200L溶液进行复溶处理，最后取5L 进样到色谱系统分析，记录多潘立酮的色谱峰面积（A 3）和内标的色谱峰面积（B 3）。则血浆样本中多潘

26、立酮的提取回收率为R =4/3 A 1/A 2 100%，内源性物质引起的基质效应为E =A 3/A 2 100%，测试结果见表1；血浆样本中内标的提取回收率（R ' =4/3 B 1/B 2 100%）为（98. 7 2. 7）%，基质效应（E ' =B 3/B 2 100%）为（98. 9 4. 7）%。5. 5稳定性考察按照前述方法配制低、中、高（1. 394，11. 15，35. 68g ·L 1）3个浓度的多潘立受试者随机分为2组，于试验前禁食10h ，试验日晨空腹用200mL 温开水送服试验制剂多潘立酮片（海南澳美华制药有限公司，规格10mg ，批号090

27、201）或参比制剂多潘立酮片（西安扬森制药有限公司，规格10mg ，批号090301）20mg 。服药后2h 内禁水；服药后4h 统一进食标准餐。20名受试者服药7d 后交叉给药，重复上述试验。每位受试0. 25h ，0. 5h ，者于给药前（0min ）及给药后5min ，0. 75h ，1h ，1. 5h ，2h ，3h ，4h ，6h ，8h ，12h ，24h ，36h 采集肘静脉血5mL ，置于肝素管中，离心分离血浆，血浆样本置于40 低温保存箱内保存待测。采用LC MS /MS法测定给药后不同时间多潘立酮的血药浓度。20名健康受试者口服多潘立酮片试验制剂和参比制剂20mg 后平均血

28、药浓度时间曲线见图3。血药浓度时间数据经DAS 2. 0软酮质控血浆样本。按“4”项下方法操作后，将得到6，12h 后的样本处理液分别在进样条件下放置0，进样分析，考察样本处理液在进样条件下存放12h的稳定性；将配制后的质控血浆样本在室温条件下放置4h 后进行处理分析，考察质控血浆样本在室温条件下放置4h 的稳定性；将质控血浆样本于40 冻存24h 后，在室温下放置至完全融解，再将“4”其置于40 冷冻，如此反复冻融3次后，按项下方法处理后进样分析，考察质控血浆样本经3个件统计分析，得到主要药动学参数见表2 。，内源性物质虽然“看不见”却仍然对良好分离时，色谱后共流出组分的响应值产生或强或弱的

29、影11响。因此，目前对基质效应的考察已成为LC MS /MS法分析生物样本时的重要内容。本研究在建立方法之初，为了提高分析通量，曾尝试使用较为以降低大简单的蛋白沉淀法配合较短的分析时间，样本量测试时的成本，结果显示基质效应导致的响应值波动会引起精密度与准确度下降。本文使用液图3Fig 320名健康受试者口服20mg 多潘立酮片剂后平均血药浓度Mean plasma concentration time curves of two domperidone时间曲线图preparations in 20healthy Chinese，液萃取法将样本处理得较为“干净”并配以较为充分的色谱分离时，基质效

30、应得以消除。参考文献1LIU Ai fen （刘爱芬）Analysis of gastrointestinal motility drugs （促胃肠动力药物探析）China Pract Med （中国实用医药），2008，34（3）：2002XU Dong hang （许东航），YUAN LOU Hong gang （楼洪刚），Hong （袁虹），et al Pharmacokinetics and bioequivalence of domp-eridone chewable tablets in healthy volunteers （多潘立酮咀嚼片的人体药动学和生物等效性）Chin P

31、harm J （中国药学杂志），2009，44（1）：433ZHUANG Xiao qing （庄晓庆）Determination of domperidone in domperidone tablets and it's content uniformity by HPLC （HPLC 法测定多潘立酮片含量及含量均匀度）Qilu Pharm Aff （齐鲁药2007，5：278事），4Maria K ，Kamila KHigh performance liquid chromatographic a-nalysis for the determination of domperid

32、one in human plasmaJ Chromatogr B ，2000，744（1）：2075Chantal S ，Jacques TAn improved HPLC assay with Veronique M ，fluorescence detection for the determination of domperidone and three major metabolites for application to in vitro drug metabolism studiesJ Chromatogr B ，2007，852（12）：6116Smit MJ ，Sutherl

33、and FCW ，Hundt HKL ，et al Rapid and sensitive liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the quantitation of domperidone in human plasmaJ Chromatogr A ，2002，949（12）：657Courtney M ，Errol B ，et al Determination of domperidone Paul A Z ，in human serum and human breast milk by high perfor

34、mance liq-uid chromatography electrospray mass spectrometryJ Chromatogr 1999，730（1）：9B ，8HAO Guang tao （郝光涛），DONG Rui hua （董瑞华），GAO et al Quantitative determination of domperi-Hong zhi （高洪志），done in human plasma by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （HPLC MS MS 法定量测定人血浆中

35、多潘立酮的浓度）Chin J Drug Appl Monit （中国药物应用2008，5（5）：19与监测），9SHI Ai ming （施爱明），HUA Wen yan （华雯研），ZHANG Quan ying （张全英）Determination of domperidone in human plasma by LC MS /MSmethod 高效液相色谱质谱联用（LC MS /MS）法测定人血浆中多潘立酮的浓度Pharm Clin Res （药学与临床研究），2008，16（1）：68表2健康受试者单剂量口服20mg多潘立酮片后的主要药动学参数（n =20）Tab 2Main pha

36、rmacokinetic parameters （mean SD ）of domperidone after an oral administration of 20mg dompe-ridone test or reference tablets in healthy volunteers参数（parameters ）T max /hC max /ng·mL 1AUC 036/ng·h ·mL 1AUC 0 /ng·h ·mL 1t 1/2/hF /%受试制剂（test preparation ）0. 7 0. 328. 5 9. 474.

37、4 24. 280. 2 24. 14. 1 1. 5102. 9 12. 6参比制剂（reference preparation ）0. 6 0. 229. 4 8. 072. 5 23. 478. 8 23. 94. 2 1. 67讨论采用液质联用法进行定量分析时，理想的内标物为待测组分的同位素标记物，但由于同位素标记物合成难度较大，成本较高，不易获得，本研究对的氨多种化合物进行了筛选。其中文献报道溴索作为内标时，方法精密度不佳，可能是因为基质效应或样本提取回收率上的差异，氨溴索不能很好补偿由此引起的多潘立酮响应波动。血浆样本处理条件摸索阶段对比了沉淀蛋白法与液液萃取法。沉淀蛋白法处理样本

38、时，质谱响应值偏低，分析原因可能是沉淀法处理血浆样本，不能彻底去除内源性物质，多潘立酮与内源性物质在LC MS 接口处竞争性地与初级离子反应，降低待测物离子的生成效率，进而使其响应值偏低。当采用氢氧化钠溶液碱化血浆样本后以有机溶剂萃取的方法时，提取效果较好，内标与多潘立酮有相似的回收率，且均不存在浓度依赖性。由于LC MS /MS法的高特异性，分析工作者一度认为色谱分离对于质谱检测的重要性下降了。但越来越多的事实表明，生物样本分析中不能实现10，12 624 10 31 （ 4 ） 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2011 ， 12 LIU Qian（ 刘茜） ， ZHENG Xiao nan （ 郑小楠） ， WANG Qian （ 王 et al Determination of domperidone concentration in human 茜） ， plasma by LC MS MS and its pharmacokinetics（ 人血浆中多潘 立酮的含量测定及药物动力学考察） Chin J Pharm （ 中国药剂 2009 ， 7 （ 3 ） ： 135 学杂志） ，