种植于硅橡胶膜上的大鼠纤维环细胞的表型特征研究

1、种植于硅橡胶膜上的大鼠纤维环细胞的表型特征研究作者：郭志良，周跃，成敏，曹国永，李华壮，滕海军【关键词】纤维环细胞；硅橡胶膜；逆转录Phe no typic characteristics of rat annu lus fibrosus cells cultured on flexible silic one membra nes【Abstract 】 AIM: To pare the phenotypic characteristics of rat annulus fibrosus (AF) cells cultured on flexiblesiliconemembraneswitht

2、he same cells cultured in plastic plates. METHODSThe morphology of AF cells cultured in differe nt substrates was observed un der an inv erted phasec on trast microscope and a tran smissi on electr on microscope.Proteoglycan was stained with toluidine blue for observing its expression. The contents

3、of collagen typeI , n and aggrecan mRNA were determined byRTPCR. The expressi on of in tegri nB 1 was mon itored by flow cytometry.Cell adhesi on to silic one membra nes was also measured. RESULTS: The AF cells cultured in differe nt substrates were morphologically undistinguishable. Toluidine blue

4、stainingshowed that there was also nodiffere nee betwee n AF cells cultured on flexible silic one membra nes and in plastic plates. The cells grow ing in differe nt substrates expressed the samelevels of collagen type I , n and aggrecan mRNAind integrin B 1. AF cells grew well o n silico ne membra n

5、es. CONCLUSION: AF cells cultured on flexible silic one membra nes main tai n the stability of phe no type and may be appropriate for further study ing the metabolic resp on ses to mecha ni cal stimuli at the cellular level.【Keywords annulus fibrosus cell; silicone membrane; reverse tran scriptasepo

6、lymerase cha in reactio n; flow cytometry【摘要】目的：比较种植于硅橡胶膜或塑料培养板的大鼠纤维环细胞的表型特征.方法：利用倒置相差显微镜及透射电镜观察种植于不同基质的大鼠纤维 环细胞形态的变化；利用甲苯胺蓝染色观检测蛋白多糖的表达情况；通过 RTPCR 法检测I,n型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA勺表达情况；采用流式细胞术观察细胞表面整合素B 1的表达情况；同时检测了纤维环细胞在硅橡胶膜上的黏附情况.结果：种植于不同基质的纤维环细胞形态学观察无明显差别；在两种基质上的纤维环细胞甲苯胺蓝染色无差异；I,n型胶原及聚集蛋白聚糖mRN股细胞膜整 合素B1的表达亦

7、无明显差异；纤维环细胞可以黏附于硅橡胶膜上生长 .结论： 种植于硅橡胶膜上的纤维环细胞表型特征无改变，为进一步研究力学刺激对纤维 环细胞的影响提供实验基础.【关键词】 纤维环细胞；硅橡胶膜；逆转录聚合酶链式反应；流式细胞术0引言下腰痛是一个重要的公共卫生问题，虽然引起下腰痛的原因很多，但是椎 间盘退变仍是其主要因素1-2 .目前的观点认为，椎间盘退变是一个由生物 化学和生物力学因素相互作用的复杂的病理过程 .由于椎间盘周围的肌肉、韧带 以及椎间盘内的静水压等因素，椎间盘始终处于负荷状态，尤其是椎间盘纤维环 细胞总是不断地受到不同形式的拉伸应力.为了从细胞水平研究生物力学因素 对细胞的影响，很多

8、研究者设计出不同的实验装置，对体外培养细胞施加不同形式的拉伸应力3-4.我们也自行设计一套对单层生长细胞进行周期性张应变 的实验装置，为对细胞施加张应力，首先需要将纤维环细胞培养于弹性硅橡胶膜 上,因此有必要对培养于新的基质上的细胞表型稳定性进行确认.细胞生长基质 可影响细胞外基质成分的表达，本实验我们比较了培养于硅橡胶膜和细胞培养板 上的纤维环细胞的细胞外基质成分的表达情况 .1材料和方法材料SD大鼠（1月龄）由本院实验动物中心提供.DMEI培养基和U型胶原酶 为Gibco公司产品，胎牛血清为PAA公司产品，纤维连接素为 Roche公司产品， Hepes为Amresco公司产品，TRIzol

9、试剂为Invitrogen 公司产品，一步法RTPCR 试剂盒为Qiagen公司产品，FITC标记抗整合素B 1单抗为BD公司产品.硅橡 胶膜为Dow Corning公司产品，细胞培养板为Corning公司产品，凝胶成像系统为 Alpha Innotech公司产品，流式细胞仪为美国 BD公司，透射电镜为日立公司产品.方法纤维环细胞的分离培养参考文献5方法，大鼠处死后，常规消毒，无菌 条件下取下脊椎，立即置入盛有 PBS液的培养皿中，去除椎间盘周围的软组织， 将L5L10椎间盘从中间切开，小心刮除髓核组织，然后用尖刀片将纤维环仔细 取下，于PBS液中漂洗三遍，然后用眼科剪剪成1 mm< 1

10、 mm< 1 mm勺小块，置g/L 胰蛋白酶中，37C下10 min，加入含血清培养基终止消化，用 PBS液清洗去除 胰蛋白酶，将组织块置1 g/L的胶原酶溶液中，37C下消化2 h, 200目滤过滤， 细胞悬液1000 r/min离心5 min,得细胞团，PBS液清洗细胞三次，清洗后的细胞，以DMEM含100 mL/L的胎牛血清，20 mmol/L HEPES, 100万U/L青霉素和 100 mg/L链霉素）悬浮，接种于培养瓶中，置 37C, 50 mL/L CO2培养箱中培 养待细胞生长汇合时，用胰蛋白酶消化，传代细胞接种于细胞培养板和自制的 细胞培养槽中，培养槽的底由硅橡胶膜制成

11、，用5卩g/cm2的纤维连接素包被.甲苯胺蓝染色和透射电镜观察单层生长的细胞用40 g/L多聚甲醛固定，g/L甲苯胺蓝染色，蛋白多糖为深紫色.通过离心的方法收集细胞团块，用戊二 醛和锇酸固定，透射电镜观察逆转录聚合酶链式反应（RTPCR细胞总RNA勺提取采用TRIzol试剂，根 据操作说明书进行.紫外分光光度计分别于260 nm和280 nm波长测定RNA勺纯 度（A260 nm/A280 nm=及定量.目的基因的扩增采用一步法 RTPC试剂盒， 所用引物情况：1型胶原（上游：5' ggtcacagcagactggaaacatcg3 '，下游：5' agggtaggga

12、gcagcagcaagag3'产物长度：487 bp；退火温度：54°C）；U型 胶原（上游：5' cgaggtgacaaaggagaagc3'，下游：5' ctggttgttcagcgacttga3 '； 产物长度：453 bp ;退火温度：55C）；可聚蛋白聚糖核心蛋白（上游： 5' cgcttgccagggggagttgtattc3'，下游：5' ggaggccagggtagcattttgagc3 '；产物长度：405 bp；退火温度：55C） ； GAPDH上游：5' tgctgagtatgtcg

13、tggagt3 '， 下游：5' agtctt ctgagtggcagtgat3 '； 产物长度：287 bp；退火温度：51C）. 反应条件为：50C，30 min； 15C， 15 min； 94C， 1 min；退火温度，45 s； 72C，1 min ； 30循环；72C，10 min. PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，摄 像后用图像分析软件进行条带灰度分析.结果用目的条带和GAPD条带的灰度 比值表示.流式细胞术单层生长的细胞用 PBS洗 2遍，然后通过消化和离心的方法收 集细胞，细胞用FCM缓冲液（含20 g/L牛血清白蛋白和g/L叠氮钠无Ca2+,

14、 Mg2+ 的PBS重悬，调整密度为109/L，细胞用FCM缓冲液洗涤后，进行抗体孵育.离 心后的细胞中加入200卩L （50 mg/L，用FCM缓冲液稀释）FITC标记的抗整合 素B 1抗体，4C避光孵育30 min，然后用PBS洗涤3次，上流式细胞仪检测， 激发波长为488 nm.每组样本检测10 000个细胞，所测得细胞荧光强度代表了 整合素B1的表达情况.同时，做阴性对照实验.细胞贴壁情况为检测细胞在硅橡胶膜上的黏附情况，我们分别在细胞接种 后的3, 6, 12和24 h,对贴壁细胞进行计数，细胞贴壁率为贴壁细胞数与总细 胞数之比.细胞接种48 h后，进行换液，然后对细胞施加 3, 6

15、和12 h的应变 为10%频率为2 Hz的周期性张应变.受力后对培养基中的脱落细胞进行计数， 然后将仍然贴壁的细胞消化下来进行计数，计算脱落细胞和贴壁细胞的比值，与未受力组相比较.统计学处理：所有实验均重复3次，结果用x±s表示，统计分析采用独立 样本t检验和x 2检验，P,图4，5）.1,4 :1型胶原；2, 5: U型胶原;3, 6 :可聚蛋白聚糖.图4不同培养基质上的纤维环细胞I型胶原、U型胶原和可聚蛋白聚糖核 心蛋白mRNA勺表达（略）图5 I型胶原、U型胶原和可聚蛋白聚糖核心蛋白 mRNA勺表达的半定量分 析（略）整合素B1的表达在本实验中未检测出在不同基质生长的纤维环细胞

16、，整 合素B 1表达的不同，其相对荧光强度分别为 819土 30和814± 33 （ P,图6）.图6流式细胞术检测不同培养基质的纤维环细胞整合素B1表达情况（略）细胞黏附接种于硅橡胶膜上的纤维环细胞，在接种后3, 6，12和24 h的贴壁率分别为（65 ± 8） % （81 ± 7） % （91 ± 10）箱口（ 99 ± 3） %与在培养板 上的相比没有统计学差异（P）.在施加3，6，12 h的周期性张应变后细胞的 脱落率分别为（土）% （±） % （±） %与未施加应变组（土）% （±） %（±）

17、%比较无差异（P）.3讨论在脊柱运动过程中，纤维环细胞受到张应力刺激，机械刺激可以影响纤维 环细胞的代谢已为很多研究者所接受研究者设计了很多的实验装置，可以在细 胞水平研究纤维环细胞对应力刺激的代谢响应6-7 .我们也自行设计了一套 实验装置，为了对细胞施加应力，必须将细胞培养于弹性硅橡胶膜上， 因此有必 要对培养于硅橡胶膜上的纤维环细胞的表型稳定性进行研究在体外高密度培养的纤维环细胞表达纤维软骨特异性的基质蛋白，可以表达I型胶原、U型胶原和蛋白多糖5.本实验中，我们将大鼠椎间盘纤维环细胞培养于纤维连接素 包被的弹性硅橡胶膜上，以便对其施加应力刺激根据Brodkin等8的研究， 纤维连接素、I

18、型胶原或U型胶原基质不影响软骨细胞的形态、基因表达、细胞外基质的形成以及细胞骨架的构造我们的结果提示纤维连接素包被的弹性硅 橡胶膜上生长的纤维环细胞可以保持其表型稳定，与培养板上的细胞没有差别.整合素作为一种重要的细胞黏附分子，可以介导细胞与周围基质的相互作用在 许多种细胞中，整合素同样参与信号转导，调节细胞的基因表达、细胞增殖及凋 亡9-12 . Nettles等13发现纤维环细胞表达整合素 B 1亚基在本实验 中，培养在不同基质的纤维环细胞表达同样的整合素B1亚基，二者并无不同另外，细胞在硅橡胶膜上的贴壁率与在培养板上没有区别这些结果提示，本实验中的培养条件对于纤维环细胞的生长是合适的最后

19、，我们对生长于硅橡胶膜 上的细胞给以应变为10%,频率2 Hz的周期性张应变，细胞没有从弹性膜上脱 落下来我们研究说明，纤维连接素包被的弹性硅橡胶膜具有好的生物相容性，大鼠椎间盘纤维环细胞可以在其上生长，并保持起生物学特性.本实验装置可以用 于周期性张应变对纤维环细胞在细胞水平的影响研究【参考文献】1 Schwarzer AC, Aprill CN, Derby R, et al. The relativecontributionsof the disc and the zygapophyseal joint in chronic low backpainJ . Spine, 1994, 19

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