RT-PCR试验方法总结大全

1、RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验有三步：抽提RNA,RT,PCR。要求：1做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng 或 lug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存 在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在 RT 时，引物设计有 3种方法即 a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer和 c:特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上，还

2、要用此产 物做PCR的模板继续扩增。如果用c方法,那么要去那里查它的序列呢？问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一 种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到 许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解!（注:已 肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不 会和这有关呢？请高手指教！解答：1. RT-PCR有两种做法:条件具备的话可用kit进行一步法进行；

3、若条件不太好的话可分两步进行逆转录 再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是 体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega。2. RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5 ,3 ' RACE物的（最好产物短点；若涉及粗略定量 的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实 很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样；体系的均一性等。3. RACE我做过RACE（3 RACE是宝生物的Kit;5 RAC是 Gibico,但现在再进行另一个同源基因的3 RACE

4、寸却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的， 其中一个已经获得了全序列（RACE的方法，而另一个基因的3' UTF却增么也扩不出 来，我推测是不是该基因的3 UTRfc长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b-actin和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不 同的刺激。有关内参：RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些，最好分开两管，把除 了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的 相对浓度。问:我曾经作过同一管的PCR,内有actin和目的基因引物。虽然可见到两条均 一条带但图片质量不理想（而且酶

5、量、Mg2+加倍。请教mxbdna2003你是如何处理 同一管的PCR的各成分的浓度？答:it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount j

6、ust using "accurate piptte" is wron g. it shoud be remembered to do the inner con trol of housekeep ing gene everytime.在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量,taq酶本来就是过量的 A-A,（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了 ,我想这肯定 再很多贴子里应该都谈到了。 Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一 条带就很好了。关键是摸,十八摸（太少,只争朝夕，开个玩笑虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必 要

7、的,首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了 ,还要考虑比较的不同的模板中的量 所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之 间。有关内参的建议：定要做内参的，每一次,我想。不作内参的结果是不可信的电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈 了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝 对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础 的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果 的,3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目

8、的基因表达相同，长度 差不多,GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。关于平台期和线性期的问题 实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶 促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。我 们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和 buffer之间的 关系,这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物 ntp都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内,所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了，再开始的时

9、候酸的是切线，这图我在*帖过。关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根 据要求，还可以专门设计隔内含子的,这样还可以用于基因组PCR、长度小于500bp- 600bp等等。引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器 里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不 用查。我反复说过了，别用软件,就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时 候，还没发现呢,跟不要说在基因组的位置和序列了 ，怎么考虑内含子的问题呢？18s的引物也和著名的B acti一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是 只能

10、用总RNA为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破 烂了。18s除了在细胞中更相同（量外,主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定 量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。我认为，就像你用某一种 东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又 29根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s,不过我们看懂使用的那条 序列，不知有没有人用过，告知其序列和gen ba nk号。正好问一下，我查了一些序列，一直没有去

11、合成，主要是因为手上的actin的荧光 探针还没有完，当初和成了一堆。有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列？原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也 能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条，许多专业书都 有详细的描述，但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因 为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特 殊性，我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同，做不出时还是要好好动一下脑 子。记得我开始

12、我的RT-PCR时，按常规方法,提取总RNA后,首先用自己设计的下 游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了 N次均没有结果。后来考虑到本人的 克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT- PCR 克隆出她的片断（尽管她用这些RT-PCR产物做模版再进行PCR时也没办法重 复出她的产物，因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的RT-PCR产 物作模板（有点改进，逆转录反应换用了 9mers随机引物，用我的引进物进行一般PCR, 终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以 说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经

13、验很重要，但有时也不定要受到 书本框框和别人经验的限制请问：1引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc和at含量算出吗？可以用引物报 告单上的Tm值吗？2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCI2应加多少？各个成分 的量有无确定标准？3 PCR结果跑电泳,actin有但跑不出目的条带,有几种原因?与 cDNA的量少有 关吗?Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？一般来说引物报告单伤得是对的，也可以自己算,实际上重要的各条引物一致，剩 下的可以摸的.20中是指体积还是量？只要不明显改变体系的离子强度，加1,2ul都可以的.mg要调的，但我总觉得没有书里讲的那么玄乎，我都是常

14、年不变的如果内参照有，目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了 在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的 RNA。而实验失败的主 要原因是核糖核酸酶（RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需 要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分 析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响 RNA分析的结果, 所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性 RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑 制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的

15、RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它 分子生物学实验中使用的 RNA酶也会造成污染。这些外源性的 RNA酶可污染器 械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞 中则含有大量内源性的RNA酶。一、防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180°C的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意:有机玻璃器具因可被氯 仿腐蚀，故不能使用。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室温10min撚后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。4

16、. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在 37C处理12hr以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配 制然后经0.22 yn滤膜过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC:是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和 RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性 ，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核

17、蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合 形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin:从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。 RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。mRNA的分离与纯化真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有 5'端帽子结构（m7G和3'端 的Poly（A尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞 mRNA的3'端存在20-30个腺苷酸组

18、成 的Poly（A尾,通常用Poly（A+表示。这种结构为真核 mRNA的提取，提供了极为方便 的选择性标志，寡聚（dT纤维素或寡聚（U琼脂糖亲合层析分离纯化 mRNA的理论基 础就在于此。mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规 方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly（A+的特点，在RNA流经寡聚（dT纤维素柱 时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在 低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT纤维柱后，即可得到较 高纯度的mRNA。寡聚(dT纤维素柱纯化mRNA一、试剂准备1.3M 醋酸钠(pH

19、 M NaOH3.1 上样缓冲液:20mM Tris-HCI(pH 7.6;0.5M NaCI;1M EDTA(pH 8.0;0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制 Tris-HCl(pH 7.6、NaCl、 EDTA(pH 8.0的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至 65 T时，加入经65E温育(30min的10%SLS至终浓度为0.1%。4. 洗脱缓冲液:10mM Tris-HCl(pH 7.6;1mM EDTA(pH 8.0;0.05% SDS5. 无水乙醇、70%乙醇6. DEPC二、操作步骤1将0.5-1.0g寡聚(dT-纤维悬浮于

20、0.1M的NaOH溶液中。2. 用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管,将寡聚(dT-纤维素装柱0.5-1ml,用 3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。3. 使用1上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。4将RNA溶解于DEPC H2O中，在65C中温育10min左右，冷却至室温后加入 等体2X上样缓冲液,混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后： 再用1X上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。5.将所有流出液于65T加热5min,冷却至室温后再次上柱，收集流出液。6. 用5-10倍柱床体积的1X上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集,OD260测定 RNA含量。前部分收集管中流出

21、液的 OD260值很高，其内含物为无Poly(A尾的 RNA。后部分收集管中流出液的 OD260值很低或无吸收。7用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱 Poly(A+RNA,分部收集，每部分为1/3-1/2 柱体积。8.OD260测定Poly(A+RNA分布,合并含Poly(A+RNA的收集管 加入1/10体积 3M NaAc(pH5.2、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀,-20 C放置30min。94C离心,10000g K5min,小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。注意:此时 Poly(A+RNA的沉淀往往看不到。4C离心,10000g 5min,弃上清，室温晾干。10.用适量的DEPC H

22、2O溶解RNA。三、注意事项1. 整个实验过程必须防止Rn ase的污染。2. 步骤(4中将RNA溶液置65C中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个 ，一 个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+尾处的二级结构，使Poly(A+尾充 分暴露，从而提高Poly(A+RNA的回收率;另一个目的是能解离 mRNA与rRNA的结 合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。3. 十二烷基肌氨酸钠盐在18C以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18C最好用LiCl替代NaCI。4. 寡聚(dT-纤维素柱可在4C贮存反复使用。每次使用前应该依次用 NaOH、 灭菌ddH2O、

23、上样缓冲液洗柱。5. 般而言,107哺乳动物培养细胞能提取1-5卩g Poly(A+RNA约相当于上柱总RNA 量的 1%-2%。RNA酶保护试验(RNase Protection Assay,RPA是通过液相杂交的方式,用反义 RNA探针与样品杂交,以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较, RPA有以下几个优点：1. 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造 成样品和探针的损失，使灵敏度下降,而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提 咼了灵敏度。2. 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应 平台”问题，基于PCR产物量进行

24、分 析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此分析的数据真实性较高。3. 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部 分降解的RNA样品仍可进行分析。4. 步骤较少,耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。5. RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6. 个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7. 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。一、试剂准备1. GACU POOL:取 100mM ATP、CTP、GTP 各2.78 小 1100mM UTP 0.06 卩加 DE

25、PC H2O 至 100 诃2. 杂交缓冲液 IPES 0.134g 0.5M EDTA(pH8.020 卩、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺 8ml,加 DEPC H2O 至 10ml。3. RNase消肖化液:5M NaCI 120 卩 IM Tris- HCI(pH7.4 20、l.5M EDTA(pH8.020 Z RNase A(10mg/ml 8 、IRNase T1(250U/ 卩 l 1 力gEPC H2O 至2ml二、操作步骤1. 反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动 子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。(1设计含T7启动子的PCR引物

26、由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5'端 要含T7启动子序列：T7 启动子序列为:5 -TAATACGACTCACTATAGGG引物设计的其他要求与一般 PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反 义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR即先扩增出 一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所 示：上游引物下游引物U T7启动子序列下游引物I(2PCR先用上游引物和下游引物I进行 PCR再以PCR产物为模板，用上游引物和下游引物U -T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节(3探针

27、合成标记与纯化在0.5ml离心管中加入下列试剂：RNasin (40U/ 卩 l 0.5 卩1GACU POOL GAC(含 GTP、CTP、ATP 各 2.75 mM,UTP 61 卩 M 2 卩1a32PUTP(10 卩 Ci/ 卩 l 2.5 卩1DTT (二硫苏糖醇,0.1M 1卩15 >转录 buffer 2 卩1模板(50ng/卩l 1卩1T7 RNA聚合酶(15U 1卩1混合后，短暂离心,37OC保温1hr。加入 DNase I (10U/ 卩 11 卩 l, 37OC 15m然后 75 OC 10min 以灭活 DNAse I 和T7 RNA聚合酶。加入:饱和酚50卩1氯

28、仿50卩1酵母tRNA(2卩g/卩l 4卩1DEPC H2O 1001室温下充分混匀，离心10000g2min。取上层液置另一 0.5 ml离心管中，加入100卩氯仿，混匀,离心10000g >2min。将上层液转移至另一 0.5ml离心管中，再加入3M NaAc 10卩、1预冷无水乙醇250卩混匀后,-20OC静置30min。4OC离心13500g XOmin。弃上清液，沉淀用75%乙醇100卩洗涤,40C离心13500g 2min,弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入 50卩杂交缓冲液溶解沉淀,40C下保存待用。 可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。(参见本节电泳步骤。2. 杂交

29、(1 RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1卩g/。1(2取8卩l RNA加入1-3卩探针(根据探针检测结果调整于0.5ml离心管中。(2 80OC 保温 2min,然后 40-45OC 下杂交 12-18hr。3. 消化(1杂交管于37 OC保温15min,加入RNase消化液,37 OC保温30min。(2加入10%SDS 1Qx、10卩g/蛋白酶K 20卩混匀,37 OC保温10min。(3加入65卩饱和酚和65卩氯仿，混匀，室温离心,10000g 2min。(4转移上层液到另一 0.5离心管中，加入10卩酵母tRNA和3M NaAc 15卩再加入200卩异丙醇，混匀后，置-20OC

30、30min,4 OC离心,135000g X0min。(5弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8卩上样缓冲液溶解沉淀。4. 电泳与放射自显影(1配制凝胶:(50ml40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19:1 6.25ml5XTBE 10ml尿素24g加 H2O 至 50ml溶解后加入25%过硫酸胺50卩l,TEMED 50卩混匀,注入电泳槽中，插入梳,待胶凝 固。(2预电泳以1XTBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置, 电压应达2000v以上，功率设定为100w,温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时， 暂停电泳，准备加样。(3加样将已溶解在加样缓冲液中的样品 8

31、0 OC加热2min,立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。(电泳条件同预电泳。(3电泳结束后，打开胶板,用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红 光下压上一张X片,盖上暗盒,-70OC曝光1-3天。暴光结束后 将X光片显影、定 影、水洗、晾干。三、注意事项1. 本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。2. RNase消化液消化未杂交的单链 RNA和探针RNA,当探针与样品之间有碱基 错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行 PCR时， 采取尽量减少错配的措施。3、 同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间 不宜过长。4、RNa

32、se消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100 倍后使用。可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内，再设计一对引物进行第二 次PCR就行了如果你的第一次PCR刚好包括目的片段，那只好设计个更长的了第二次的引物设计要求可以低一点以50卩体系为例弓I物各1卩1第一次PCR产物5卩1二次PCR和巢式PCR,即设计两对引物进行扩增，不是一个概念,它是拿第一次 的PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反应,以期增加产物的 量我做RT-PCR时提总RNA时，都是用灭菌DEPC水，按1:10

33、0稀释后测OD260 和OD280,后根据公式:RNA浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul,后用1mg total RNA分离 mRNA.做逆转录及PCR效果很好.luoyu10 wrote:各位大哥：我有一个问题请教,RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少 如果太低是不是会影响结果？最低到1.8,最好2.0,我感觉稍微低一点影响不算太大。问:我是RT-PCR的新手，想请教引物如何设计？好的引物所具有的令人满意的特点*典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序 列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于 24核苷的引物并不意味着更

34、高 的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交 ，降低了特异性，而且比短序列杂 交慢，从而降低了产量。*选择GC含量为40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。*设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序 列杂交的稳定性。*避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。*避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。*避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。*避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制

35、位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进 行互补性和内部二级结构的检测。有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列 可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同 序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用 偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在 引物的3端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始 PCR。使用较高的引物浓度（1 yM到3卩M因为许多简并混合物中的引物不是特异性 针对目的模板。【经验】如何确认RNA的质量各位都知道，提取到质量良好的RNA （包括总RNA和mRNA ,以下同） 是非常困难，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢？或许各位非常关心 呢，我是这样 想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看 到的，内容当 然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问 题，所以希望 大家自己多多思考啊！以下两种方法，相信大家都知道的：1）检测RNA溶液的吸光度280