三种荧光定量PCR检测方法比较

1、三种荧光定量PCR佥测方法比拟定量pcr :以参照物为标准,对PC总产物进行分析或对 PCR±程进行监测,从而到达 评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量 PCR定量PCR的可行性定量一般是在 PCRT增的指 数期进行的.常见荧光定量PCR佥测方法可分为以下几类：(1) SYBR Green I检测模式SYBRGreen I是一种能与双链 DNA结合发光的荧光染料.其与双链DNA结合后,荧光大大增强.因此,SYBR Green I的荧光信号强度与双链 DNA的数量相关,可以根据荧 光信号检测出PCR体系存在的双链 DNA数量.SYBRGreen I的最大吸收波长约为 497nm, 发射波

2、长最大约为 520nm°PCR扩增程序一般为 94 c55c72c三步法,40个循环.SYBR Green I的缺点：由于 SYBR Green I没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会 结合发光,对PCR反响中的非特异性扩增或 引物二聚体也会产生荧光,通常本底较高,所 以在临床上使用可能会有假阳性发生.SYBR Green I的优点：SYBR Green I的优点是由于其缺点产生,由于它能所有的双 链 DNM目结合,所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针,通用性较好,并且价格 相对较低.这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比拟普遍.SYBR. GREEN I工d卡

3、原理(2)水解探针模式(taq man探针)5'末端, 而淬灭剂那么在3'端的淬灭剂接近而被淬灭.TaqMan探针是一种寡核甘酸探针,荧光基团连接在探针的使得荧光基团与淬灭剂别离,随着扩增循环数的增加,3'末端.当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与在进行延伸反响时, 聚合酶的5'外切酶活性将探针切断,射荧光.一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生.1 / 10放出来的荧光基团不断积累.因此Taqman探针检测的是积累荧光.PCR扩增程序通常是:94c60 C 40个循环.常用的荧光基团是FAM, TET, VIC, HEXPKUIIIt bi 口

4、i» t* h Q - AUL«dC«iL»iU"V白Cl 口Taqiiian探针I ：作原理(3) 杂交探针模式(Beacon、FRET)分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核甘酸探针,两端的核酸序列互补配对, 因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近.荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭,由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来.分子信标的茎环结构中,环一般为 15-30个核甘酸长,并与目标序列互补；茎一般5-7个核甘酸长,并相互配对形成茎的结构.荧光基团标记在探针的一端,而淬灭剂那么标记在另一端.在复性温度下

5、,由于模板不存在时形成茎环结构,当加热变性会互补配对的茎环双链解开,如果有模板存在环序列将与模板配对.与模板配对后,分子信标将成链状而非发夹状,使得荧光基团与淬灭剂分开.当荧光基团被激发时,因淬灭作用被解除, 发出激发光子.由于是酶切作用的存在,分子信标也是积累荧光.常用的荧光基团： FAM , Texas Red.PCR扩增程序通 常是：945572 C三步法,40个循环.2 / 10TargetMotecuiar BeaconH/brid分子信标I：作原理FRET探针又称双杂交探针,FRET探针由两条相邻探针组成,在一条探针的5'端标记FAM荧光基团,另一探针的 3'端标记

6、Red 640荧光基团.当复性时,探针结合在模板上, FAM基团和Red640基团相邻,激发FAM产生的荧光,作为Red640基团的激发光被吸收, 使Red640发出波长为640的荧光.当变性时,探针游离,两基团距离远,不能产生640波 长的荧光.由于FRET探针是靠近发光, 所以检测信号是实时信号,非累积信号.常用的荧光基团是：LC-Red640, LC-Red705.3 / 10AB 1 ' FlDonaturaiioriPrimer and probsnnaalmgFRET工作原理能用于实时荧光 PCR定量的方法很多,各有优缺点,应根据实验的需要和当前的实验 条件选择适合自己的方

7、法.下面为各种方法的比拟：实验中的一些好习惯：参加试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均；移液枪用完之后要归到最大计量的位置,预防久而久之弹簧失去弹性.一定要记着关水浴箱,切记切记 ；多和大家讨论,同时多关注别人讨论的经验,这几乎 是最快提升的捷径了 ；所有的试剂都自己配,出了问题才好找原因.4 / 10预防RNA酶污染的举措:1 .所有的玻璃器皿均应在使用前于180c的高温下干烤6h或更长时间.2 .塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐 蚀,故不能使用.3 .有机玻璃的 电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇枯燥,再浸泡在3%HaC2

8、 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干.4 .配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC在37c处理12h以上.然后用高压灭菌除去 残留的DEPC不能高压灭菌的试剂, 应当用DEPCb理过的无菌双蒸水配制, 然后经0.22 滤膜过滤除菌.5 .操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换.6 .设置RNAlt作专用实验室,所有器械等应为专用.常用的RNA酶抑制剂：1 .焦磷酸二乙酯DEPC:是一种强烈但不彻底的 RNA®抑制剂.它通过和RNAB的活 性基团组氨酸的咪陛环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性.2 .异硫鼠酸月瓜：目前被认为是最有效的RNAB抑制剂

9、,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活.它既可破坏 细胞结构 使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA®有强烈的变性作用.3 .氧钮核糖核昔复合物：由氧化锂离子和核昔形成的复合物,它和RNA®结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNAB的活性.4 . RNA酶的蛋白抑制剂RNasin:从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白.RNasin是RNAI每的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNAB结合,使其失活.5 .其它：SDS尿素、硅藻土等对 RNAB也有一定抑制作用.由于DEP怀加选择的修夕蛋白质和RNA因此在别离和纯化 RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液例如Tri不能相容在所

10、有RNA验中,最关键的因素是别离得到全长的RNA而实验失败的主要原因是核糖核酸酶RNA酶的污染.RNA®可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等.研究人员造成的污染 RNMB最主要的潜在污染源是研究人员的手.因此进行RNA实验时应勤换手套.但DEPCt归与胺和疏基反响,因而含Tris和DTT的试剂不能用 DEPCb理动植物总 RNAj取-Trizol 法：5 / 10Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至 几克.用Trizol法提取的总RNA色无蛋白和 DNA亏染.RNA可直接用于 Northern斑点分 析,斑点杂交,Poly(A)+别

11、离,体外译,RNase封阻分析和分子克隆.1 .将组织在液N中磨成粉末后,再以 50-100mg组织参加1ml Trizol液研磨,注意样 品总体积不能超过所用 Trizol体积的10%2 .研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液参加0.2ml的比例参加氯仿, 盖紧 离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒.3 .取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例参加异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟.4 .弃去上清液,按每 ml Trizol液参加至少1ml的比例参加75叱醇,涡旋混匀,4 C 下7500g离心5分钟.5 .小心弃去上清液,然后室温或

12、真空枯燥5-10分钟,注意不要枯燥过分,否那么会降低RNA的溶解度.然后将RNA§于水中,必要时可55C-60 c水溶10分钟.RNAM进行mRNA 别离,或贮存于70成醇并彳存于-70 C.注意1 .整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作.另外,提取上清这步一定要小心,靠近沉淀的局部一定要舍得不要,要不然会有蛋白 质污染,影响比值2 .加氯仿前的匀浆液可在-70 C保存一个月以上,RNA沉淀在70吐醇中可在4c保存一周,-20 C保存一年.总mRNA勺提取经验：一、 关于Trizol Reagent需要的试剂1. Chloroform :氯仿(分析纯)2. Isopro

13、plyl alcohol :异丙醇(分析纯)3. 75%Ethanol(in DEPC-treated water) : 75叱醇.要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPCM理过的无Rnase的水稀释.4. RNase-free water :无 Rnase 的水.方法是：将 DEPC$ 0.01%(V/V)力口在 d H2O 中 500ml(50ul),在37c过夜,并高压灭菌即得 (150 C 3小时)5. 一次性塑料手套6. 注意：DEPCT致癌之嫌6 / 10二、关于Trizol Reagent的使用过程:1. Homogenization 匀浆a. Tissues :组织每100

14、mg组织匀浆加ImlTrizol试剂,样品体积不能超过Trizol试剂的10%b. Cells Grown in monolayer单层细胞接毒后出现病变的 针又JEV细胞总RNA勺抽提法：BHK21细胞长成单层后,接毒0.5-1ml采用大瓶,37c吸附1h,倒掉,加维持液含2渊血#和HEPE8的MEM豹5ml,维持天.出 现75%-100%勺病变时,以 PBS预冷冲洗细 胞两次,直接在细胞瓶中参加Trizol试剂1ml/10cm2,吹吸几次,以裂解细胞细胞瓶有两种常用规格：大的约45cm2,小的约30cm2,故所用Trizol试剂分另约为4.5ml和3ml °Trizol 试剂的参

15、加是依细胞瓶而定,以盖满瓶底为度,而不是依据细胞的数量,否那么可导致DNA的污染具体方法如下：样品一定要新鲜1组织接入预冷的 EP管中,参加Trizol试剂1ml/10cm2量一定要加足,否那么易污 染,混匀,吹吸几次,以破裂细胞,置室温5min,以使核蛋白复合物彻底别离.2加氯仿0.2ml每1ml Trizol试剂参加氯仿0.2ml,盖好,剧烈震荡15s,置室温 2-3分钟.（3） 4c离心,10000gx 15min,离心后,混合物将别离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相.RNA&含在水相中,水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%4仔细吸取上层水相,移至

16、另一EP管中.5加0.5ml异丙醇,以沉淀RNA每1ml Trizol试剂参加0.5ml异丙醇,置室温10min.6 4 C离心,10000g X10min.RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁.7弃上清液,参加预冷的 75叱酉I 1ml每1ml Trizol 试剂参加75叱醇至少1ml, 震荡,充分洗涤沉淀,4c离心,5500gx 5min.弃上清液,空气枯燥 或真空枯燥后,沉淀 重悬于无Rnase dH2O中,吹吸几次,55C-60 c作用10分钟以溶解 RNA -70 C保存备用.8抽提出的细胞总 RNA枯燥后加水50ul ,取10ul加无Rnase水990ul ,稀释100

17、倍 成1ml.于0.5cm厚的石英比色杯中,以无Rnase水为对照,在721型紫外分光光度计下检测,结果应为： A260/280 ratio<1.6 .（9） 别离组织10mg纯组织力口 800山Trizol试剂.10扩增产物的鉴定.7 / 10DEPO理方法如下:1 . DEPC 处理：(1)DEPC水：100ml超纯水参加 0.2ml DEPC,充分混匀,高压灭菌.(2)Tip头(枪头)、EP管等在提RN网:程中及做RT时接触RNA勺器材(包才1ml、200 口、 20 口 Tip头;EP管和PC版应管等)：用0.1%的DEPCK (1000 ml超纯水参加1ml DEPC)37c

18、浸泡过夜,高压灭菌.2 .提取RNA用DEPCCK溶解.3 . RT :我是用PCF来限制温度和时间的,所以 RT是在PCR反响管中作的.4 .操作过程中要戴一次性手套,并经常换手套.最好把要直接接触木¥品的东西都用DEPOK处理一下,枪头盒插好枪头后,参加 1-2ml的0.1%DEPCK,在灭菌就行了 ；现在有进口的 RNASE FREE勺枪头买,直接用不用处理的.如何消除污染：机器运行完后,取出 PCRT物时不能随便丢弃,应该用塑料手套或其他打结包好后丢 入垃圾桶.(1)试齐J: mixer尽量分装,不要原瓶屡次取用.(2)加样：原那么是 DNAt后加,其他试剂根据体积大小从大往

19、小的加.如果是同种引物 和探针有多管的话只是 DNA不同,那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面,混合均匀之后再分装到各个管子里去,这样可以有效地预防误差及污染.另外,普通实验室容易污染,且污染程度很高,与跑电泳还有质粒制备提取都在同一 个房间里有比拟大的关系,最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释.目前,国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG防污染.Uracil-DNAN-glycosylase(UNG)尿喀咤DNA®基酶,来源于大肠杆菌重组克隆表达.RNAt 量：RNAfe最好至少要用电泳,一方面定量,另一方面可以看看完整性.至于用分光光度计 比拟 不同标

20、本之间就更不准了.RNA勺贮藏,最主要的是温度,-20不够,最好-80,液氮最保险.mRN座不能代替蛋白水平的分析的,由于还有译效率和RNA降解速度的影响.RT-PCR有两种做法：8 / 10条件具备的话可用 kit进行一步法进行；假设条件不太好的话可分两步进行逆转录再 PCR两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,由此推测是体系更加单一比拟 利于PCR的进行.一定要做内参的,不作内参的结果是不可信的.电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量mRNA勺别离与纯化中.步骤(4)中将RNA溶液置65 c中温育然后冷却至

21、室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA勺二级结构,尤其是 mRNA501y(A+)尾处的二级结构,使 Poly(A+)尾充分暴露,从而提 高Po1y(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离 mRNAf rRNA的结 合,否那么会导致 rRNA的 污染.所以此步骤不能省略.下面,我们介绍一个可以确认RNA容液中有没有残留的 RNAB的方法.保温试验：方法很简单的,根据样品浓度,从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNAm入至0.5 ml的离心管中,并且用 pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积,然后密闭管盖.把其中 一份放入70c的恒温水浴中,保温 1 h o另一份放置在-20 C冰箱中保存1 ho时间到了之后,取出两份样本进行电泳.电泳完成后,比拟两者的电泳条带.如果两者的条带一致或者无明显差异 (当然,它们的条带也要符合方法2中的条件),那么说明RNA溶液中没有残留的 RNA®污染,RNA勺质量很好.相反的,如果70c保温的样本有明显的降 解,那么说明RNAm中有RNA®污染.PCR亏染与对策：PCFT增产物污染.这是PCR反响中最主要最常见的污染问题,所以,扩增区的仪器什 么如枪头等要注意.还有一种容易无视,最可能造成PCRT物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶,在操作时比拟剧烈地摇动反响