BDNF及受体TrkB在大鼠小脑的表达研究

1、BDNF及受体TrkB在大鼠小脑的表达研究【摘要】 目的：研究BDNF 及其受体TrkB在大鼠小脑时空分布变化。方法：进行免疫组织化学实验，观察BDNF及TrkB在正常大鼠发育期、成年期和老龄期小脑内的定位分布及时间变化。结果：发育期小脑皮质的外颗粒层、梨状细胞层和内颗粒层均有BDNF表达，梨状细胞层的阳性Purkinje细胞染色明显。成年期内颗粒层阳性细胞逐渐增多，梨状细胞层的Purkinje细胞BDNF表达及阳性细胞数量达高峰。老年期阳性细胞染色强度呈增龄减低，Purkinje细胞发生了轻度的退行性变，TrkB表达在小脑皮质分布模式类似BDNF的表达。结论：BDNF及TrkB表达的时空变化

2、始终与小脑皮质的发生发育过程相关。生后0天，二者在小脑皮质外颗粒层、梨状细胞层和内颗粒层均有较强表达，以梨状细胞层为主。第10天左右，小脑皮质发育为典型的三层结构，Purkinje细胞表达BDNF及TrkB最为显著。成年后，表达水平保持较稳定。老龄后明显减弱，BDNF及TrkB阳性Purkinje细胞发生轻度的退行性改变。 【关键词】 BDNF；TrkB；免疫组织化学染色；大鼠；小脑；表达Study the Expression of Neuiotrophin Factor and Tyrosine Kinase Receptor in Rat CerebellumAbstract:Objec

3、tive Study systematically the distribute of BDNF and TrkB in the normal rat cerebellum.Methods Observe systematically the expression changs of BDNF and TrkB in the normal rat brains during devolopement phase and adulthood and aged phase and thire relationship.Results BDNF and TrkB were expressed in

4、cerebellum during devolopement phase The external granule layer became molecular layer along with the migration of granule cells to the internal granule cell layer, and the immuostaining cells increased gradully during adulthood. phase The Purkinje immuoreactive cells appear to peak. BDNF and TrkB w

5、ere expressed significantly in Purkinje cells during adulthood. During aged phase, Purkinje cells slightly degenerated.Conclusion The expression of BDNF and TrkB reached a peak in cerebellum of rats on PND 20. The expression of BDNF and TrkB decreased gradually after adulthood. During aged phase, th

6、e expression of BDNF and TrkB increased significantly, and the form of the cell celloccured degeneration.Key words:BDNF；TrkB；SABC;Rats；Cerebellum；Expression 神经营养因子(NTF),是一类对中枢和外周神经系统均有营养作用的活性蛋白, 这些小分子蛋白质具有55%65%相同的氨基酸顺序,统称为神经生长因子家族,包括神经生长因子(NGF), 脑源性神经营养因子(BDNF),神经营养因子3(NT3),神经营养因子4/5(NT4/5)，神经营养因子6

7、(NT6) 和 神经营养因子7(NT7)14。NTFs受体有两种不同的家族，一种受体是低亲和力的神经生长因子受体（P75），P75是肿瘤坏死因子家族成员之一，可以无选择地和所有的神经营养因子结合，发挥生物效应。另一种受体是高亲和力酪氨酸激酶家族(Trks)受体TrkA、TrkB、TrkC 。TrkA是NGF的受体,TrkC是NT3的受体,TrkB的最适配体为BDNF,也是NT4/5的最适配体和NT3的第二配体57。BDNF及TrkB对神经元的生存、生长、分化有重要的影响。在神经系统发育过程中，BDNF可诱导神经前体细胞的定向分化，促使神经元增生，加快神经元迁移，促进神经系统的成熟和完善。在成体

8、，BDNF则表现出广泛的神经营养和神经保护活性，可以促进神经元对葡萄糖等能量物质的利用，提高细胞酶的活性。对神经元的存活及正常生理功能的维持有着积极的意义。BDNF及TrkB广泛分布于中枢神经系统。近年,大量的工作主要集中于研究BDNF及TrkB的生理作用及在神经系统疾病或损伤中的变化,也有一些有关脑发育过程中BDNF mRNA表达变化的报道。但未见有系统地观察机体正常发育过程中BDNF及TrkB在中枢神经系统中时空分布的研究报道。为此，本研究拟应用免疫组织化学ABC法，观察BDNF及TrkB在正常大鼠发育期、成年期、老龄期小脑内的定位分布及时间变化规律。以期为探讨BDNF及TrkB在神经系统

9、生长发育过程中的作用提供较系统的形态学资料。1 材料与方法1.1 仪器与试剂 AO光学显微镜、CS202型电热保温干燥箱、CS213型电热培养箱、Series1000振动切片机。兔抗大鼠BDNF抗体、兔抗大鼠TrkB抗体、大鼠SABC试剂盒（即用型）、3，32氨基联苯胺（DAB），试剂均为Sigms公司产品。1.2 实验动物及分组 实验用SD大鼠。种鼠均由西安交通大学医学院实验动物中心提供。雄鼠10只，体重为200 g220 g；雌鼠40只，体重280 g300 g，按雄、雌鼠1：4于每日晚10:0011:00合笼，次日晨7:008:00检查雌鼠阴道分泌物。用醮水棉签探入雌鼠阴道，顺时针或逆时

10、针旋转2圈3圈后取出，涂于干净载玻片，镜下观察，发现絮状精子，即确认为怀孕。孕鼠分笼单养，标记受孕时间，至孕21天生产。取同窝幼鼠2只3只，12只构成一组，并记录出生时间。以出生后0天即第1个24 h为P0组, 依此类推分为：发育期（P0、P5、P10、P15、P20、P25、P30）、成年期（P60、P90、P120、P150、P180）、老年期（P360、P540、P720、P900）共16组, 每组12只。1.3 免疫组化学实验1.3.1 组织制备 动物经水合氯醛（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，打开胸腔，经心尖插入钝注射针头至主动脉根部，剪开右心房；快速灌注温生理盐水约200 ml；

11、注入冷的4%多聚甲醛400 ml，先快后慢，持续1 h；断头取脑，置相同固定液后固定过夜；次日，组织行振荡切片，片厚40 m；小脑皮质的切片6套，分别用BDNF、TrkB免疫组化染色。1.3.2 SABC法免疫组织化学染色 切片经PBS清洗3次，10 min/次；0.3%H2O2中30 min，以消除内源性过氧化物酶，PBS清洗3次，10 min/次；1% Triton中30 min，PBS清洗3次，10 min/次；正常兔血清封闭液30 min；入一抗（BDNF抗体浓度为1：200，TrkB抗体浓度为1：100），于4 冰箱内孵育72 h，期间每天摇动3次，并注意密封，然后再经PBS洗3次，

12、10 min/次；生物素化二抗，37 孵育1 h， PBS洗3次，10 min/次；SABC复合物，37 孵育30 min， PBS洗2次，10 min/次，TBS洗1次，10 min；DAB显色，注意避光，放入切片显色1 min5 min，镜下观察染色，尽可能使背景染色一致；PBS洗3次，10 min/次，蒸馏水洗3次，5 min/次；裱片阴干，常规脱水，透明，树胶封片。1.4 结果及数据处理 光镜下观测小脑皮质半球后外侧部，每部位取5个视野，计数BDNF、TrkB阳性神经元的数目。所获数据行方差分析统计学处理，并定义P<0.05为差异有显著性界值，P<0.01为高度差异有显著性

13、界值。数据处理过程由SPSS for Windows软件完成。2 结果2.1 BDNF染色 生后0 d，小脑皮质的外颗粒层、梨状细胞层和内颗粒层均有BDNF表达，染色明显。梨状细胞层的阳性Purkinje细胞胞体较大，轮廓依稀可见，呈不规则的单层排列，胞浆染色较深，胞核不着色。内颗粒层有较多而散在分布的BDNF阳性神经元，染色较阳性Purkinje细胞淡，轮廓不清。外颗粒层也可见少量的阳性细胞。出生后5 d、10 d和15 d，随着外颗粒层细胞穿过梨状细胞层向内迁移至内颗粒层，三层内的阳性细胞染色强度逐渐加深，以Purkinje细胞BDNF表达增加为主，但未见阳性突起。同时内颗粒层深部的小脑白

14、质出现了染色较强的阳性纤维，并深入内颗粒层。生后20 d、25 d，随着小脑皮质三层结构发育的逐渐成熟，外颗粒层逐渐转变为分子层，随之阳性细胞逐渐减少，染色变淡。内颗粒层阳性细胞逐渐增多胞体较小，染色较深。梨状细胞层的Purkinje细胞BDNF表达及阳性细胞数量达高峰，P<0.05,差异有显著性，细胞呈规则的单层排列，胞浆染色明显加深，细胞轮廓清晰，突起仍不明显，胞核依旧空染。白质中的阳性纤维染色较P15组弱，纤维增粗，亦可见走入内颗粒层。从25 d起，生长、发育到老年的早期（P360组），阳性免疫反应产物的模式未变，阳性细胞主要为梨状细胞层的Purkinje细胞，在分子层和内颗粒层有

15、散在分布的阳性细胞，所有阳性细胞形态、染色强度与P20组基本一致。内颗粒层纤维的BDNF表达量较分子层高。老年期从P540组、P720组到P900组，阳性细胞染色强度呈增龄减低，P>0.05，差异无显著性，阳性Purkinje细胞发生了轻度的退行性变，表现为染色变淡，数量有所减少，胞体轮廓皱缩，外观僵直，胞核形态不规则。分子层和颗粒层仍有极淡染的少量阳性细胞。本实验于小脑皮质发育的不同阶段，对BDNF表达的主要神经元阳性Purkinje细胞进行了计数，发现细胞数的高峰出现在PND20到PND25，见图1、图3。图1 小脑皮质BDNF及TrkB阳性细胞数略2.2 TrkB染色 生后0 d，

16、小脑皮质的外颗粒层、梨状细胞层和内颗粒层均有TrkB表达，染色较弱。梨状细胞层的TrkB阳性Purkinje细胞胞体较大，轮廓依稀可见，呈不规则的单层排列，胞浆染色较深，胞核不着色。内、外颗粒层未见TrkB阳性神经元。生后5 d、10 d和15 d，随着外颗粒层细胞穿过梨状细胞层向内迁移至内颗粒层，内、外颗粒层也出现阳性细胞，染色较Purkinje阳性细胞弱，所有阳性细胞轮廓不清，未见阳性突起。生后20 d、25 d，小脑皮质的三层结构清晰，TrkB免疫反应染色逐渐加深，阳性细胞数达最高峰。颗粒层出现散在阳性细胞，胞体较大，染色较深。梨状细胞层的Purkinje细胞呈规则的单层排列，胞浆染色明

17、显加深，细胞轮廓清晰，突起仍不明显，胞核小而空染。从25 d起，生长、发育到成年180 d，阳性免疫反应产物的模式未变，阳性细胞主要为梨状细胞层的Purkinje细胞，在分子层和内颗粒层有散在分布淡染的阳性细胞，阳性细胞数量有所减少，染色较淡。在PND25，所有阳性细胞的染色强度达高峰，P<0.05,差异有显著性，大多数阳性Purkinje细胞的胞核呈不均匀染色阳性。老年的早期（P360组）到P900组，阳性细胞染色强度呈增龄减低，分子层和颗粒层阳性细胞明显减少，仅有极少数阳性细胞散在分布。与成年期比较，阳性Purkinje细胞数量变化不大，P>0.05，差异无显著性，但形态发生了

18、轻度的退行性变，染色变淡，胞体轮廓僵直，胞核形态不规则，见图2。图2 不同季度阳性细胞数直方图略图3 小脑皮质BDNF、TrkB免疫组化染色略3 讨论BDNF对神经元的生存、生长、分化和可塑性有重要影响。在神经系统发育过程中，BDNF通过TrkB受体的介导可诱导神经前体细胞的定向分化，加快神经元迁移，促使神经元增生，确保神经系统的成熟和完善。在成体，则表现出广泛的神经营养和神经保护作用，对神经元的存活、正常生理功能的维持及损伤后的修复有着积极的意义。神经营养因子假说理论8认为，处于发育中的神经元，其存活依赖于它所支配的靶细胞产生的特殊的营养因子。在发育早期，各类神经元的数目过量，那些生长到错误

19、靶组织或在靶组织错误定位的多余神经元因得不到足够的营养因子而退化9。BDNF基因敲除大鼠大部分在生后两天即死亡，少数可存活2周3周8。我们的实验结果从正面支持了神经营养因子假说理论，也符合大鼠个体生长发育在生后2周3周处于高峰，4周以后全身器官发育已基本完成这一事实。国内外关于BDNF在小脑皮质表达的研究甚少，仅有的几篇报道也不系统。本研究首次系统观察了大鼠小脑皮质BDNF及受体TrkB终生的时空表达。结果显示BDNF及受体TrkB表达的时空变化始终与小脑皮质的发生发育过程相关。在PND0时，小脑皮质发育尚未成熟，呈现外颗粒层、梨状细胞层和内颗粒层这样的原始分层状态，此时即有BDNF及受体Tr

20、kB在三层中的较强表达，尤其梨状细胞层的Purkinje细胞表达相对较强。随着皮质发育的逐渐成熟，外颗粒层由于细胞不断内迁至内颗粒层以及深层细胞突起的外伸而逐渐发育成分子层，梨状细胞层和颗粒细胞层逐渐发育成熟，至PND10时已发育为典型的小脑皮质三层结构。在此期间BDNF及受体TrkB的表达也随之发生相应的改变，外颗粒层BDNF及受体TrkB阳性细胞的数目和表达强度均逐渐下降，而其它两层阳性细胞的数目和表达强度均不断升高，以梨状细胞层的阳性Purkinje细胞表达最为显著。在PND20和PND25时，Purkinje细胞BDNF及TrkB的表达达高峰，成年后，二者的表达水平轻度下降后进入一个较

21、稳定的平台期。从PND360开始，小脑皮质步入老龄期改变，BDNF及TrkB的表达也出现明显的减弱，阳性Purkinje细胞发生了轻度的退行性变，染色变淡，数量减少，胞体轮廓皱缩，外观僵直，胞核形态不规。上述BDNF及TrkB表达的变化规律较客观地体现了二者参与小脑皮质生后从发育、成熟到衰老的过程。梨状细胞层Purkinje细胞是小脑皮质惟一的传出神经元，其内BDNF及TrkB呈持续性高表达，与二者在大脑皮质的表达相呼应，即小脑新皮质的进化程度与大脑新皮质发生发育相一致，充分表明BDNF及TrkB在锥体外系和锥体系的躯体运动调节中占有重要地位。【参考文献】 1 Finkbeiner S,Tav

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