沙门氏菌的检验

1、沙门氏菌的检验食品学院14食品质量与安全1班刘文敏 柳基炜 卫杰恒 温紫君201430520115 201430520116 201430520121 201430520122摘要：本实验采用GB/T4789.4-2010的检测方法测定鸡场中的沙门氏菌。通过本实验学习沙门氏菌的检测方法和技术， 了解沙门氏菌的一些生化特性；本实验 先用显色培养基找出可疑菌落，再做生化试验找出可疑的典型性的沙门氏菌， 再 通过血清学试验最终确定是否为沙门氏菌属。关键词：沙门氏菌 接种 生化试验 血清学鉴定、，.刖 百沙门氏菌病是公共卫生学中具有重要意义的人畜共患病种之一， 其病原沙门 氏菌属于肠道细菌科。沙门氏菌

2、是一个统称，泛指2000多种有紧密连系的细菌， 包括引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。虽然只有少数人因沙门 氏菌而患病，但是，在世界范围内的细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的占大多数。因此，采用科学、合理的方法检验食品中沙门氏菌，已经成为了人们 最关心的问题之一。国标法（GB4789.4-2010）是目前中国规定的食品中沙门氏 菌的标准检测方法，也是基层实验室普遍采用的检测方法，它根据沙门氏菌的生 长特点和生化特性，采取前增菌、增菌、分离、生化试验和血清学鉴定5个步骤进行o1材料与方法1.1 实验材料1.1.1 仪器设备均质器、三角烧瓶、平皿、玻璃棒、接种棒恒温培养箱：36c

3、± rc, 42c ± 1C吸管：1 mL （具0.01 mL亥ij度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸头精品 电子天平PL602-S,梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅 SYQ-DSX-280B上海中安医疗器械厂1.1.2 试剂药品鸡肠、靛基质试剂、沙门氏菌 O和H诊断血清、API20E生化试剂盒或VITEKGNI 生化鉴定卡1.1.3 培养基蛋白陈水（BPW/）四硫磺酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（S。增菌液、亚硫 酸钿（BS）琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂、蛋白陈水、尿素琼脂、氟化钾、氟化 钾对照、赖氨酸脱竣酶、赖氨酸脱竣酶对照

4、、甘露醇、山梨醇、B -D半乳糖甘（ONPG培养基1.2 实验方法1.2.1 培养基的制备1.2.1.1 培养基的配制步骤蛋白陈水（BPW：称取蛋白陈10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钠1.5g、 蒸储水1000ml,将各成分加入蒸储水中，搅混均匀，静置约 10 min,煮沸溶解， 调节pH,高压灭菌121 C, 15 min。分装10瓶，每瓶90ml四硫磺酸钠煌绿（TTB：高压灭菌121 C, 15 min灭菌冷却后至30C,每100ml 基础培养液加碘液2ml,煌绿液1ml1.2.1.2 配制培养基的注意事项（1）按照说明书上的用量进行换算，称取准确分量的合成培养基粉末；（2）加

5、热煮沸溶解培养基时，留意锅内水位的变化，水位下降可再添加适量的水，以免水分蒸发过多，导致后面分装不够量；（3）往试管中放小导管时，注意处理气泡。1.2.2沙门氏菌群检测1.2.2.1 沙门氏菌检测程序精品2沙门氏菌检测操作步骤精品2.1 前增菌称取10 g （mD样品放入盛有90 mLBPW勺无菌均质杯中，以8 000 r/min 10 000 r/min 均质1 min2 min ,或置于盛有90 mL BPW勺无菌均质袋中，用 拍击式均质器拍打1 min2 min。使用均质袋，可直接进行培养，于36 C±1 C 培养8 h18h。2.2 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1

6、mL,转种于10mL TTB内，于42 C ±1C培养18h24h0同时，另取1mL转种于10mL SC内，于36C ± 1C培养 18 h 24h。2.3 分离分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE琼脂平 板。于36c ±1C分别培养18 h24 h （HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基 平板） 或40h48h （BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上 的菌落特征见表1表1沙门氏菌属在不同选择性隙脂平板上的南落畤征法择性焦脂平板沙门氏前BS琮脂崩落为骞鱼有金属光电粽褐色或灰包国落周用培养基可呈,色或惊色有些 菌株形成想色的窗

7、落周周培姆不受.HE琮脂盗球色或/&多裁菌落中心翳包或几乎全需色有些窗侏为黄色中心第色戢 JL乎全雪仇XLDO富常呈杼圻£带或不密昙色中心自些好一可呈现大的带光糖的再色亡3或 以无全部思色的麟；有咎茵收为黄色菌落或不常黑色中心.沙i氏南前色培林按照显色焙养基的舸进肚底2.4 生化试验2.4.1 三糖铁琼脂和赖氨酸脱竣酶试验自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂， 先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱竣酶试验培 养基和营养琼脂平板，于36C ±1C培养18h24h,必要时可延长至48h。在三 糖铁琼脂和赖氨酸脱竣酶试验

8、培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。精品表2沙门氏菌属在三精珍坛雷为赖氨酸脱段甄试骑培养基内的反应菇果三度翔第梭引教股控装讨配格第甚初步删制同底层产气晚化星KA+ (-)+ (-)+砒处n氏两属KA+ (-)+ (-)可疑沙门氏菌属AA+ (-)+ (-)可疑眇门氏0AA+/一+/羊沙口氏腐Kk+ / 一+/:涉n扉生l产诚.生产续阳性，-：用性：+ r 多粒阳性，少依阴性2 + -：汨性或用性，在三糖铁琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱竣酶试验阴性的菌株可以排除。其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能， 同时也均有不是沙门氏菌属的 可能。2.4.2 系列生化反应试验接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱

9、竣酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白陈水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氟化钾（KCN培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36c ± 1 C培养18 h24 h ,必要时可延长至48h,按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2c5c或室 温至少保留24h,以备必要时复查。13沙门氏诲属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢 （H2S）靛基质pH 11尿素鼠化仰（KCM核氨酸脱发醒A1f+A2+A3/ 由+阳性；-阴性；+/-阳性或阴也2.4.3 反应序号A1 :典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱竣酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门

10、氏菌，如有2项异常为非沙门氏菌。精品表沙门氏南屋生化反应初步鉴别表pH U尿索裂化号KCX）赖氨酸 m.二.<网副凌沙门氏南陵求端学鉴定绪果）一M氏菌IV或"要求符合本群生化特性）+沙门氏酊利变体I妾求端学凝结果）注标币生+表示阴也2.4.4 反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项 试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。2.4.5 反应序号A3:补做ONPG ONPG1性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱竣酶阳 性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱竣酶阴性。2.4.6 必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。表5沙门氐蔺属各生化群的鉴力项口IHIIIIV

11、VX工才醉+山梨醵+水畅育一+一ONPG+丙二叠起+KCN+注，+表示阳性;一表示圉性C2.5 血清学鉴定滴一定生理盐水在载玻片靠近磨砂的一边作对照，在另外一边滴一滴血清，用灭菌后的接种环从三糖铁琼脂培养基的斜面取一点菌种， 放进血清中，然后用酒 精灯将接种环灭菌冷却后，再取少量菌种放进生理盐水中。观察血清中的的菌落 是否凝结，与生理盐水中的菌落对比。2.6 结果与报告精品综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告 25 g （mD样品中检出或未检 出沙门氏菌。3实验结果与分析3.1.1 沙门氏菌检测现象和结果（见表 7）表7沙门氏菌检测现象和结果试齐硫化氢蛋白陈（加 靛基质）尿素氟化钾赖氨酸脱

12、竣酶现象黑色/、父色桃红色不浑浊绿色结果+-+-+注：+阳性，-阴性3.1.2 实验结果分析对照沙门氏菌生化反应初步鉴定表， 尿素，氟化钾，赖氨酸脱竣酸三项中有 两项异常，按沙门氏菌生化鉴定表可判定结果为非沙门氏菌属03.1.3 甘露醇和山梨醇试验现象和结果甘露醇和山梨醇都变成黄色，表现为阳性。需要补做血清学鉴定试验。3.1.4 OPNG试验现象和结果OPN变成深黄色，表现为阳性，为非沙门氏菌属。3.2.1 血清学鉴定实验现象和结果血清中的菌落没有出现凝结现象，与生理盐水中的菌落现象一样。3.2.2 实验结果分析血清学鉴定结果为该菌落为非沙门氏菌属。4实验结论与讨论结论：综合以上生化试验和血清

13、学试验的结果，25g样品中未检出沙门氏国局。讨论：沙门氏菌是重要的肠道致病菌，肠炎沙门氏菌是其中的一种，常引 起鸡、鸭等禽类感染，还可引起食物中毒2,但是实验结果显示为非沙门氏菌属， 可见实验结果的正确性可信性不高，实验过程中可能存在操作失误（如接种环还 未冷却就取种，导致菌种死亡）或者其他原因导致实验偏差，应该重新做实验， 严格按照国标再次进行试验，提高实验的准确性和可信度。鉴于鸡肉等畜禽产品精品 污染沙门氏菌所引起食源性疾病的风险，越来越多的学者投入到其生产加工环节 的溯源研究中。传统的血清学方法由于存在着抗原的变异及不同种属菌间的交叉 反应等，其应用受到了一定限制精品网。而ERIC-PCR技术具有操作简便、重复性强，灵敏度高、鉴别能力强、 所需仪器设备简单、成本低等优点，成为细菌基因分型、流行病学调查研究领域 里强有力的工具4。.5检验报告报告阴性结果：25g样品中未发现沙门氏菌。参考文献1陈玲.食品中沙门氏菌检验方法的研究J.科技与创新，2015,8.2孙园园，赵鹏等.沙门氏