酶工程的研究新进展

1、L/O/G/O酶工程的研究新进展酶工程的研究新进展L/O/G/O酶的化学修饰酶的化学修饰酶的化学修饰的定义酶的化学修饰的定义 对酶在分子水平上用化学方法进行改造，即在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质的技术。 天然酶的缺陷天然酶的缺陷易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；容易受产物和抑制剂的抑制；工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内；底物不溶于水，或酶的米式常数过高；酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用。酶化学修饰的目的酶化学修饰的目的u研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）u人

2、为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）4）产生新的催化能力酶化学修饰的种类及应用酶化学修饰的种类及应用酶的表面化学修饰酶分子的内部修饰酶的表面化学修饰酶的表面化学修饰u大分子修饰（大分子结合修饰）大分子修饰（大分子结合修饰）u目前应用最广的酶分子修饰方法。水溶性大分子通过共价键与酶分子表面结合，形成覆盖层。u修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。u如：PEG超氧化物歧化酶（SOD）、

3、PEG溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）、PEG天门冬酰胺酶（ASNase）小分子修饰小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）（酶蛋白侧链基团修饰） 侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。包括氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 主要反应：烷基化反应、酰化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应 修饰剂：采用的各种小分子化合物，如2，4二硝基氟苯、碘乙酸；乙酸酐、邻苯二酸酐；H2O2、2巯基乙醇；四硝基甲烷、卤素。烷基化反应烷基化反应酰基化反应酰基化反应 连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。氧化还原反应氧化还原反应（四硝基甲烷）芳香环取代反应芳香环取代反应碘代：碘代： I2 + HI 硝

4、化：硝化： (NO2)4C + + (NO2)3CH 交联修饰（交联法）交联修饰（交联法）u用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。固定化修饰（共价偶联法）固定化修饰（共价偶联法）u通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。酶分子内部修饰酶分子内部修饰u（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰） u（二）氨基酸置换修饰（催化和非催化活性基团的修饰）u（三）金属离子置换修饰（辅因子修饰）修饰酶的特性修饰酶的特性 热稳定性提高 抗各类失活因子的能力提高：蛋白酶、抑制剂、酸、

5、碱、有机溶剂 抗原性消除：免疫应答 体内半衰期延长：药用疗效 最适pH改变：接近生理环境 酶学性质改变：Vm，Km，底物专一性 对组织分布能力改变：靶器官L/O/G/O模拟酶模拟酶模拟酶的定义模拟酶的定义 根据酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物。模拟酶的酶学基础模拟酶的酶学基础酶的作用机制：过渡态理论对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究理论基础理论基础 主-客体化学：主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补 超分子：该分子形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，当接受体与络合离子或分子结合形成稳定的，具有稳定结构和性质的实体，形成

6、超分子 功能：分子识别、催化、选择性输出模拟酶的分类模拟酶的分类根据Kirby分类法按照模拟酶的属性根据根据Kirby分类法分类法单纯酶模型：以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性机制酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子按照模拟酶的属性按照模拟酶的属性主-客体酶模型胶束酶模型肽酶抗体酶分子印迹酶模型半合成酶主主-客体酶模型客体酶模型模拟的胰凝乳蛋白酶侧链上接上羟基、咪唑基、羧基。分子印迹酶模型分子印迹酶模型 分子印迹概念：制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。分子印迹的原理分子印迹的原理分子印迹的过程分子印迹的过程 1、选定印迹分子和功能单位，让它们之间发生互补作用，形成印迹分子功能单位复合物。 2、用交联剂在印迹分子功能单位复合物周围发生聚合反应，形成交联的聚合物。 3、从聚合物中除去印迹分子，得到对印迹分子具有选择性的聚合物。分子印迹酶分子印迹酶 通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。 性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常数。非水相介质中的酶反应（P247-249）定义、优势、溶剂系统、有