抗疲劳实验方法

1、抗疲劳作用检验方法1负重游泳试验1.1 原理运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最有力的宏观表现，游泳时间的长短可以反应动物运动疲劳 的程度。1.2 仪器游泳箱（大小约50cmiX 50cnT 40cm），电子天平、铅皮。1.3 实验方法1.3.1 实验动物成年雄性小鼠，体重18-22g,推荐使用BALB/c小鼠。1.3.2 剂量设置共设高、中、低、对照四个组，根据推荐的人体每公斤体重日摄入量，扩大10 倍作为其中一个剂量组，根据受试物的具体情况另设两个剂量组。经口给样。原则上连续给样30d, 也可根据试验需要自行设定给样期限。1.3.3 实验步骤末次给予受试物30min后，置小鼠在游泳箱中游泳，水

2、深不少于30cm水温25。C± 0.5 ° C ,鼠 尾根部负荷5%体重的铅皮。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠游泳时间（min）。1.4 数据处理及结果判定游泳时间为计量资料，可以用方差分析。若受试物组游泳时间明显长于对照组游泳时间， 且差异有显著性（p V 0.05）,可以判定该实验阳性。1.5.1 每一游泳箱一次放入的小鼠不宜太多，否则互相挤靠，影响实验结果。1.5.2 水温对小鼠的游泳时间有明显的影响，因此要求各组水温控制一致，以 25c为宜，如果过低可能引起小鼠痉挛，影响实验结果。1.5.3 铅皮缠绕松紧应适宜。1.5.4 观察者应在整个实验过程中使每只小

3、鼠四肢保持运动。如果小鼠漂浮在水面四肢 不 动，可用木棒在其附近搅动。1.5.5 不同批的小鼠因饲养环境、季节等原因的变化体质上会出现差异。因此受试物组和 对照组应采用同一批动物同时进行。2爬杆试验2.1 原理运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最有力的宏观表现，爬杆时间的长短可以反应动物静用力时 疲劳的程度。2.2 材料爬杆架。直径0.8 - 1cm长约25cm的有机玻璃圆棒（经120目砂纸打磨），上端固定于木 板上，下端悬空，距地面约20cm结构见示意图。（图略）2.3 实验方法2.3.1 实验动物 雄性成年小鼠，体重18 22go推荐使用BALB/C2.3.2 剂量设置同1.3.2。2.3.3

4、 实验步骤实验时，将爬杆架置于水温15C、深约10cm的水盆中。末次给予受试物30min后开始实验，将小鼠放在有机玻璃棒上，使肌肉处于静力紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳从有机玻璃棒上跌落下来的时间，第三次落水时终止实验，累计三次的时间作为爬杆时间。2.4 数据处理及结果判定爬杆时间为计量资料，可以用方差分析。若受试物组爬杆时间明显长于对照组爬杆时间，且 差异有显著性（p v 0.05）,可以判定该实验阳性。2.5 注意事项2.5.1 实验前小鼠经筛选，训练数次仍不肯爬杆者，废弃。2.5.2 杆的质地和光滑程度明显影响小鼠的爬杆时间，要求杆的质地坚硬，光滑程度一致，以免小鼠爪子将杆表面刮损，影响

5、光滑程度。3血清尿素氮测定二乙酰一月亏法3.1 原理样品中尿素在氯化高铁一磷酸溶液中与二乙酰一月亏和硫氨胭共煮，形成一种红色的化合物， 其颜色的深浅与尿素含量成正比，与同样处理的尿素标准管比较，可求出其含量。3.2 仪器与试剂721分光光度计，10mL带塞试管，1mL （或1.5mL）塑料离心管，电炉，锅,灌胃针头。试剂盒；若无试剂盒，可自行配制试剂lg/L二乙酰一月亏溶液：取二乙酰一月亏1. 0g ,氨基硫版（thiosemicarbazide） 0. 2g ,氯化 钠4. 5g ,溶于蒸储水并加至1000mLo33g/L三氯化铁溶液：取三氯化铁L 0g溶于浓磷酸20mL中，加蒸僧水10mL

6、摇匀。酸溶液:取蒸馄水800mL慢慢加入浓硫酸50mL边加边摇;再加入85%磷酸50mL摇匀。加入33g/L 三氯化铁溶液1. 5mL加水至1L。10mmol/L尿素标准液（尿素氮28. Olmg/dL）:精确称取尿素（AR） 150. 3mg溶于16mmol/L苯甲酸溶液并加至250mLo16mmol/L苯甲酸液：取苯甲酸2.0g溶于蒸储水1000mL中，加浓硫酸0. 8mL。3.3 实验方法3.3.1 实验动物 雄性成年小鼠或大鼠，小鼠体重18-22g,大鼠体重160-200g。推荐使用BALB/C小、鼠，Wistar或SD大鼠，3.3.2 剂量分组、给样途径及期限大鼠以人体推荐量的5倍为

7、基本剂量。其余同1. 3. 23. 3.3实验步骤3. 3. 3.1 末次给受试物30min后，在温度为30C的水中游泳90min,米血测定。3. 3. 3. 2 样本准备 大鼠米尾血，小鼠拔眼球米血0. 5mLo草酸盐、肝素或EDTA抗凝 的血浆或血X o血清中的尿素在室温下可稳定24h,在4 - 6c可稳定7d以上。3. 3. 3. 3操作步骤3 3 3 3 试剂盒按照说明书操作 JL3 3 3 39自行配制试剂按下表操作乙俵略)充分混匀，置沸水浴准确15min,立即用自来水冷却。用波长520nm以空白管调零，读 取各管 吸光度(A值)。3.3.4尿素氮含量计算A “ 山粉3. 3.社试别

8、盒方法尿索札E ig/dL )=X 20.0 ( BB/dL )A " - A *3.3.4.2 自配试剂尿素(m mol/L) = AuX 10/As尿素氮(mg/dL) = AuX 28. 01/As式中Au测定管吸光度As一标准管吸光度 3.4.2 结果判定统计方法可用方差分析。若受试物组高于对照组，且差异有显著性(p V 0. 05),可判定为该受试物有减少疲劳小鼠尿素氮产生的作用。3.5 注意事项3.5.1为避免色度转移，应在标本加入后30min内读出吸光度值。3.5.3煮沸时间应准确。4肝糖原测定慈酮法4.1 原理慈酮可与游离糖或多糖起反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620n

9、m处有最大吸收。测定其光密度，可以确定糖原的含量。4.2 仪器与试剂4.2.1 仪器721型分光光度计，离心机，扭力天平，匀浆器，振荡器，沸水浴，灌胃针头，手术器 械，玻璃漏斗，加样器，2mL 5mL 10mL吸量管，20mL带塞刻度试管，10mL带塞离心管。4.2.2 试齐 IJ5%三氯醋酸(用蒸馄水配)(TCA)葡萄糖标准液浓硫酸(AR)慈酮试剂：溶液中含0.05%的慈酮，1%勺硫服,用72%勺HSQ配制。72%2SQ配制：烧杯中加入280mL蒸储水，再加入高纯度的浓硫酸720mL比重L 84)慈酮试剂配法：当SQ温度降至80- 90C时放入500nig纯的慈酮，10g高纯度的硫眠，适当

10、摇动烧杯混匀。冷却后存放于冰箱中，可保存两周。4.3 实验方法4.3.1 剂量设置、给样途径及给样期限大鼠剂量以人体推荐食用量扩大5倍作为基本剂量，其余同1.3.2。4.3.2 实验步骤1.1.1.1 样本制备末次给样后30min,在温度为30C的水箱中游泳90min,立即处死，取肝脏经生理盐水漂洗后用 滤纸吸干，精确称取肝脏200mg加入4mLTCA每管匀浆Imin,将匀浆液倒入离心管，以3000转/min 离心15min,将上清液转移至另一试管内。在沉淀中再加入4mL TCA匀浆lmi n,再次离心15nli n,取上清液，并与第一次离心的上清液合并，充分混匀。取1mL上清液放入10mL离

11、心管中（每样品可做两平行管以保证获得可靠结果），每管加入95% 勺乙醇4mL充分混匀至两种液体间不留有界面。用干净塞子塞上，室温下竖立放置过夜（也可选用 将试管放在37- 40E水浴3h）。沉淀完全后，将试管于3000转/min离心15min。小心倒掉上清液 并使试管倒立放置10mi no用2mL蒸储水溶解糖原，加水时将管壁的糖原洗下。如管底的糖原不立即溶解，振荡管子直 到完全溶解。制作试剂空白和标准管：试剂空白：吸2mL蒸饱水到干净离心管标准管：吸0.5mL葡萄糖标准液（含lOOmg/dL葡萄糖）和L 5mL蒸储水放入同样的管子。1.1.1.2 测定样品糖原含量此时将10mL慈酮试剂用力加入

12、各管，液流（慈酮试剂）直接进入管子中央，保证充分混合好。 从管子中注入慈酮试剂时起，将管子放在冷水龙头下冲凉。在所有管子都达到凉水温度后，将其浸 于沸水浴（水浴深度略高于管子液面）15min,然后移到冷水浴，冷却到室温。将管内液体移入比 色管，在620nni波长，用试剂空白管调零后测定吸光度。并根据标准曲线计算出糖原含量，根据所 称取的肝脏重量换算成肝糖原含量（以mg/g肝表示），并进行统计学处理。1.1.1.3 糖原含量计算：每100克肝姐织叩第麻IW丸救一X 0. 5 X-X 100 X 0, 9D6肝爻且秋克敢DU样品管吸光度DS:标准管吸光度0.5 ：为0. 5mL葡萄糖标准液液中的葡

13、萄糖含量。0.9 ：为将葡萄糖换算成糖原的系数。4.4 数据处理及结果判定所得数据为计量资料，可用方差分析或t检验。若受试物组肝糖原含量明显高于对照组，且 差异有显著性(PV 0. 05),可判定该受试物有促进糖原储备或减少糖原消耗的作用。4.5 注意事项4.5.1 测定的实验方法均为定量要求，因此所有取样加试剂均需准确。4.5.2 糖原测定中冷却、加热时间与氧化还原作用有关，因此时间要控制准确。4.5.3 意酮显色剂不稳定，以临用时配制为宜，注意避免采用绒布或被污染的糖类进入意酮反应。5乳酸测定5.1 原理在铜离子催化下，乳酸与浓硫酸在沸水中反应，乳酸转化为乙醛，乙醛与对羟基联苯反 应产 生

14、紫色化合物，在波长560nm处有强烈的光吸收，故可进行定量测定。5.2 仪器与试剂5.2.1 仪器 微量吸管，恒温水浴锅，电热水箱，分光光度计。5.2.2 试剂4%CuSiO浓硫酸(AR)l%NaF溶液蛋白沉淀剂：按体积分别取一份10%的鸨酸钠，一份1/3 mol/L硫酸，再与28份蒸锵水混合即成沉淀剂一NaF混合液：按体积分别取3份沉淀剂，1份1% NaF混合即成1. 5%对羟基联苯溶液：称取1. 5g对羟基联苯溶于100mL热的0. 5% NaOH中（可保存半年） 乳酸标准储备液（lmg/mL）:称取106. 6mg乳酸锂或171mg乳酸钙，以10%勺三氯乙酸定容至100mL （室温下可保

15、存半年）乳酸标准应用液（O.Olmg/mL）:准确吸取L 0mL乳酸标准储备液稀释定容至100mL此液 要求 现用现配5.3 实验方法5.3.1 实验动物同3.3.1。5.3.2 剂量设置、给样途径与期限大鼠以人体每日每公斤体重推荐量的5倍为基本剂量，其余同1.3.2。5.3.3 实验步骤5.3.3.1 游泳末次给样30min后负重2%体重）在温度25 30C的水中游泳60min后停止， 安静15min后米血备用，大鼠米尾血，小鼠拔眼球米血。5.3.3.2 操作步骤于5mL试管中加入0. 48mL l%NaF溶液，准确吸取全血20 口 1加入试管底部。用试管上部 清 液清洗微量吸管数次，再加入1.5mL蛋白沉淀剂，振荡混匀，于3000r/min离心lOmin,取上清液， 按下表操作。（表略）上述步骤完成后，摇