血清蛋白的聚丙烯酰胺电泳

1、学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术( (一一) ) 带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。的电极作定向移动的现象称为电泳。 1. 分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等 2. 分析某种物质的纯度及分子量分析某种物质的纯度及分子量 3.电泳技术与层析法结合可用于物质的结构分析电泳技术与层析法结合可用于物质的结构分析 4.免疫电泳可提高对蛋白质的鉴别能力免疫电泳可提高对蛋白质的鉴别能力 待分

2、离大分子的性质待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状。：所带的电荷、分子大小和形状。 分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。其电泳迁移速度越快。 电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离；电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离； 缓冲缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加；过低，电泳时间增加，液水分蒸发过多，离子强度增加；过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。冷却装置。 电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗电

3、渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。电泳的影响因素电泳的影响因素 支持介质的筛孔支持介质的筛孔 ：筛孔越小，则颗粒在移动的：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。过程中所受到的阻力也就越大。 缓冲液缓冲液pH和离子强度：和离子强度：pH值距离其等电点愈远，值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大 ；但是但是pH过高或过低引起蛋白变性；缓冲液通常

4、过高或过低引起蛋白变性；缓冲液通常要保持一定的离子强度，强度过低，则缓冲能力要保持一定的离子强度，强度过低，则缓冲能力差，不易维持差，不易维持pH恒定，离子强度过高，在待分恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为速度减慢。一般所用离子强度为0.020.2之间。之间。( (二二) ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法, ,由由丙烯酰

5、胺丙烯酰胺( (Acr) )单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺( (Bis) )在在催化剂作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。催化剂作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。当当Acr和和Bis遇到自由基时，便能聚合。引发自由基产遇到自由基时，便能聚合。引发自由基产生的方法有两种：化学法和光化学法生的方法有两种：化学法和光化学法. .1.凝胶聚合催化体系凝胶聚合催化体系 化学聚合的引发剂是过硫酸胺（简称化学聚合的引发剂是过硫酸胺（简称AP）。在。在催化剂催化剂N，N，N，N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺 （简称简称TEMED）的作用下，由的作用下，由AP形成氧自由基而引发聚合反

6、应，形成氧自由基而引发聚合反应，由于反应需要由于反应需要TEMED的游离碱基，所以在低的游离碱基，所以在低pH下，下，聚合反应可能延迟甚至被阻止。增加聚合反应可能延迟甚至被阻止。增加TEMED或过或过硫酸铵浓度可以增加聚合反应速度，但速度过快硫酸铵浓度可以增加聚合反应速度，但速度过快影响制板操作，两者浓度过高也影响蛋白质活性。影响制板操作，两者浓度过高也影响蛋白质活性。 （1）光催化：核黄素光催化：核黄素 （2）化学催化：化学催化：AP-TEMED 催化体系催化体系 TEMED（四甲基乙二胺四甲基乙二胺）催化催化AP（过硫酸胺过硫酸胺）生成硫酸自由基生成硫酸自由基：S2O82 2SO4 硫酸自

7、由基的氧原子激活硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：单体并形成单体长链：Bis将单体长链间连成网状结构：将单体长链间连成网状结构： 化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 催化剂和加速剂的浓度催化剂和加速剂的浓度 pH 碱性条件碱性条件 温度温度 分子氧分子氧 杂质杂质 分子量范围分子量范围 适用的凝胶浓度适用的凝胶浓度/ /( (%) ) 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5蛋白分子

8、量范围与凝胶浓度的关系蛋白分子量范围与凝胶浓度的关系2. 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关 3.聚丙烯酰胺凝胶有下列特性聚丙烯酰胺凝胶有下列特性(1) 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2) 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，很多溶剂中化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，很多溶剂中 不溶；不溶；(3) 对对pH和温度变化较稳定；和温度变化较稳定；(4) 几乎无吸附和电渗作用，只要几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，纯度高，操作条件一致， 则样品分离重复性好；则样品分离

9、重复性好；(5) 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；(6) 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓 度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7) 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛 和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖 电泳等有更高的分辨率。电泳等有更高的分辨率。4.聚丙烯酰胺凝胶种类聚丙烯酰胺凝胶种类(1)连续系

10、统与连续系统与不连续系统不连续系统两大类两大类 不连续系统不连续系统: :是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优

11、越性，分辨率高。但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。 (2)常用的多为圆盘电泳和板状电泳，原理完全相同常用的多为圆盘电泳和板状电泳，原理完全相同。 (3)不连续体系不连续体系: :电极缓冲液、浓缩胶及分离胶电极缓冲液、浓缩胶及分离胶浓缩胶是由浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为液为pH 6.7的的Tris-HC1。分离胶是由分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为液为pH 8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是电极缓冲液是pH 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。甘氨酸缓冲液。 1) 样品浓缩效应样品浓缩效应

12、 A. 凝胶孔径不连续性凝胶孔径不连续性 B. 缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pH值的不连续性值的不连续性 C. 电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性 2) 分子筛效应分子筛效应 3) 电荷效应电荷效应(4) 不连续体系凝胶对蛋白的分离作用不连续体系凝胶对蛋白的分离作用三三. . 实验器材实验器材1 1、电泳仪、电泳仪, ,电泳槽及其附件电泳槽及其附件2 2、培养皿、培养皿3 3、脱色摇床、脱色摇床4 4、烧杯、烧杯5 5、移液枪、移液枪6 6、吸量管、吸量管7 7、枪头等、枪头等四四. . 实验试剂实验试剂 ( (参考参考P121)P121)1.1. 人血清；人血清；2.2. 分离胶缓

13、冲液：分离胶缓冲液：Tris-HClTris-HCl缓冲液缓冲液 PH8.9PH8.9；3.3. 浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液: Tris-HCl: Tris-HCl缓冲液缓冲液 PH6.7PH6.7；4.4. 分离胶贮液分离胶贮液:Acr 28.0g,Bis 0.735g,:Acr 28.0g,Bis 0.735g,无离子水溶解定容至无离子水溶解定容至100ml100ml； 5.5. 浓缩胶贮液浓缩胶贮液: Acr10.0g,Bis2.5g,: Acr10.0g,Bis2.5g,无离子水溶解定容至无离子水溶解定容至100ml100ml；6.6. 1.6% 1.6% 过硫酸铵溶液过硫酸铵溶液: 1

14、.6g : 1.6g 过硫酸铵溶于过硫酸铵溶于100ml 100ml 无离子水中；无离子水中； 7.7. 电泳缓冲液电泳缓冲液: Tris-: Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液PH8.3,PH8.3,用时稀释用时稀释1010倍；倍；8.8. 1% 1% 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250；6% 6% 乙酸溶液；乙酸溶液；40% 40% 蔗糖溶液；蔗糖溶液； 0.1% 0.1% 溴酚蓝溶液溴酚蓝溶液 ( (一一) ) 垂直平板电泳槽的安装垂直平板电泳槽的安装( (二二) ) 凝胶的制备凝胶的制备( (三三) ) 加样加样( (四四) ) 电泳电泳( (五五) ) 固定和染色固定和染色(

15、(六六) ) 脱色脱色五五. . 操作步骤操作步骤 ( (一一). ). 垂直平板电泳槽的安装垂直平板电泳槽的安装 ( (二二). ). 凝胶的制备凝胶的制备名称名称分离胶缓冲液分离胶缓冲液分离胶贮液分离胶贮液 1.6%1.6%过硫酸胺（过硫酸胺（APAP） 无离子水无离子水体积比例体积比例1 1（2 2号）号）2 2（4 4号）号）1 1（6 6号）号）4 4取量取量 mLmL1 12 21 14 41.1. 分离胶的制备分离胶的制备 (7%) (7%) 配配8mL8mL迅速混匀迅速混匀 取取6mL6mL沿壁加样沿壁加样, ,基本上加到基本上加到2/32/3处处, ,再取大约再取大约3 3

16、mLmL水加在上面补满覆盖水加在上面补满覆盖室温静置室温静置30 min 30 min ( (烘箱烘箱3737度度, ,凝聚速度快凝聚速度快) )名称名称浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液浓缩胶贮液浓缩胶贮液1.6% 1.6% 过硫酸胺过硫酸胺（APAP）40% 40% 蔗糖蔗糖体积比例体积比例1 1（3 3号）号）2 2（5 5号）号）1 1（6 6号）号）4(94(9号）号）取量取量 mLmL0.50.51 10.50.52 22.2.浓缩胶的制备浓缩胶的制备 (2.5%) (2.5%) 配配 4 4 mLmL迅速混匀迅速混匀, , 取取3 3 mLmL沿壁连续平稳加样到分离胶上面沿壁连续平稳加样到

17、分离胶上面, ,直至离边直至离边缘缘5mm5mm处处, , 迅速插入加样梳迅速插入加样梳, , 室温或室温或3737度烘箱静置一段时间度烘箱静置一段时间. .加样梳需一次平稳插入加样梳需一次平稳插入, ,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡, ,梳底需水平梳底需水平. .凝聚后倒出上层的水凝聚后倒出上层的水, ,用小滤纸条吸去表面水分用小滤纸条吸去表面水分凝胶凝聚后，垂直拔出加样梳，用窄条滤纸吸去样凝胶凝聚后，垂直拔出加样梳，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的液体。品凹槽中多余的液体。( (三三). ). 进进 样样将凝胶板放在电泳槽内，将凝胶板放在电泳槽内， 加入稀释加入稀释1010倍的倍的Tris

18、Tris甘甘氨酸电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约氨酸电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm,0.5cm,即即可加样可加样要使凝胶凹形样品槽内的气泡全部排出要使凝胶凹形样品槽内的气泡全部排出, ,否则会影否则会影响加样效果响加样效果. .注意短玻璃板是向内侧的。注意短玻璃板是向内侧的。取血清样品取血清样品0.1ml,40%0.1ml,40%蔗糖溶液蔗糖溶液0.2ml,0.05%0.2ml,0.05%溴酚蓝溶溴酚蓝溶液液0.05ml0.05ml混合后，用微量注射器取上述混合液，通过混合后，用微量注射器取上述混合液，通过缓冲液，距凝胶凹形样品槽底三分之一处进样缓冲液，距凝胶凹形样品槽底三分之一处

19、进样, , 待所待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 每个同学可做梯度上样每个同学可做梯度上样, , 10l10l注射器不可过低注射器不可过低, ,以防刺破胶体以防刺破胶体, ,也不可过高也不可过高, ,否则在否则在样品下沉时会发生扩散样品下沉时会发生扩散. .( (四四). ). 电电 泳泳 将电泳仪的正极负极与电泳槽连接（将电泳仪的正极负极与电泳槽连接（方向切勿接错方向切勿接错）将电泳缓冲液倒入电泳外槽，打开电泳仪开关，开始时将电泳缓冲液倒入电泳外槽，打开电泳仪开关，开始时将电压调至将电压调至150150200V200V，待样品进入分离胶时，将电压，待样品进入分离胶时，将电压调至调