杂交与芯片-13龙洞班

1、分子杂交与生物芯片技术分子杂交与生物芯片技术核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 概念：具有互补序列的两条核酸单链在概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。的过程。 探针探针 待测核酸待测核酸 杂交分子杂交分子 核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交的基本方法核酸分子杂交的基本方法 探针的标记探针的标记核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理DNA变性变性 方法方法* 热变性：热变性：90100* 酸碱变性：常采用碱变性酸碱变性：常采用碱变性* 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等化学试剂变性：尿素、甲酰胺

2、、甲醛等 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(melting temperature,Tm)DNA复性或杂交复性或杂交(hybridization) DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等等Equations for calculating TmHybridsTm (C)DNA-DNA81.5 + 16.6(log10Na+a) + 0.41(%GCb) - 500/LcDNA-RNA or RNA-RNA79.8 + 18.5(log10Na+a) + 0.58(%GCb) + 11.8(%GCb)2 -820/LcOligo-

3、DNA or oligo-RNAd2 x no. of AT base pairs + 4 x no. of GC base pairsa. Or for other monovalent cation, but only accurate in the 0.01-0.4 M range b. Only accurate for %GC from 30 to 75 % c. L = length of duplex in base pairs d. Oligo = oligonucleotide; only accurate for lengths up to 20 nucleotides (

4、low GC content) or up to 40 nucleotides (if GC content is high). e. For each 1% formamide, the Tm is reduced by about 0.6C, while the presence of 6M urea reduces the Tm by about 30C. Each 1% of mismatching reduces the Tm by approximately 1C. 影响杂交的因素影响杂交的因素 核酸分子的浓度和长度核酸分子的浓度和长度 浓度大，复性快；分子量大，复性慢浓度大，复性

5、快；分子量大，复性慢 温度温度 离子强度离子强度 杂交液中的甲酰胺杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应非特异性杂交反应 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA杂交炉杂交炉德国Peqlab* Perfect Blot 分子杂交炉分子杂交的基本方法分子杂交的基本方法 Southern 印迹法印迹法 Northern 印迹法印迹法 斑点印迹杂交斑点印迹杂交 原位杂交原位杂交 Western 印迹法印迹法 液相杂交液相杂交Southern 印迹杂交印迹杂交 1975年，英国年，英国Southern创建创建 DNA/DNA杂

6、交，即将杂交，即将DNA电泳、转印到电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。固相支持物上，用探针进行检测的方法。 Southern杂交可用来检测经限制性内切杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的酶切割后的DNA片段中是否存在与探针片段中是否存在与探针同源的序列。同源的序列。Southern 杂交杂交(Southern bloting)的主要步骤的主要步骤 待测待测DNA样品的制备、酶切样品的制备、酶切 待测待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中凝胶中DNA的变性：碱变性的变性：碱变性 Southern转膜：转膜： 硝酸纤维素硝酸纤维素(NC)膜、

7、尼龙膜膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备探针的制备 Southern杂交杂交 杂交结果的检测杂交结果的检测Southern 凝胶转移杂交技术凝胶转移杂交技术Southern blot 技术逐步图解技术逐步图解Northern 印迹杂交印迹杂交(Northern bloting) 检测检测RNA（主要是（主要是mRNA）的方法）的方法 与与Southern杂交的不同杂交的不同 靶核酸：靶核酸：RNA RNA电泳电泳 转膜：不需变性转膜：不需变性-1，4糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达斑点印迹杂交斑点

8、印迹杂交(dot bloting) 将将RNA或或DNA变性后直接点样于变性后直接点样于NC膜或膜或尼龙膜上尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样优点：简单、快速、可同时检测多个样品品 它是一种简便、快速、经济的分析它是一种简便、快速、经济的分析DNA或或RNA的方法的方法,在基因分析和基因诊断中在基因分析和基因诊断中经常用到经常用到,是研究基因表达的有力工具。是研究基因表达的有力工具。 但由于目的序列未与非目的序列分离但由于目的序列未与非目的序列分离,不不能了解目的序列的长度。能了解目的序列的长度。 尤其当本底干扰较高时尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序难以区分目的序列信号和干扰信号

9、。列信号和干扰信号。 （二）原位杂交（二）原位杂交 用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。 原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。 特点特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态原位杂交的步骤： 取材 组织、细胞固定 预杂交 杂交 放射自显影或免疫酶法显色 观察结果 图1：免疫组化CD34表达

10、。 图2：细胞凋亡。 图3：原位分子杂交BCL-2表达。 图4：包虫病Eg95抗原在肝细胞中的表达。 图5：白介素在移植动物模型中的表达。 图6：CD8在移植动物模型中的表达。睫状神经节营养因子（睫状神经节营养因子（CNTF）在大鼠脊髓中的表达）在大鼠脊髓中的表达NGFmRNA在正常小鼠颌在正常小鼠颌下腺中的表达下腺中的表达NGFmRNA在铅中毒小在铅中毒小鼠颌下腺中的表达鼠颌下腺中的表达染色体原位分子杂交技术染色体原位分子杂交技术 FISH（Chromsome Analysis by Fluorescence in situ Hybridization）的发展为研究染色体上）的发展为研究染色

11、体上DNA的序列提的序列提供了一个最直接的方法。具有经济、安全、快速、稳供了一个最直接的方法。具有经济、安全、快速、稳定，灵敏度高等优点。定，灵敏度高等优点。 多彩多彩FISH可在同一核内显示两种或多种序列，还可对可在同一核内显示两种或多种序列，还可对间期核染色体进行研究；应用不同的探针可显示某一间期核染色体进行研究；应用不同的探针可显示某一物种的全部基因，某一染色体染色片段及单拷贝序列；物种的全部基因，某一染色体染色片段及单拷贝序列；结合共焦激光显微镜可对间期核及染色体进行三维结结合共焦激光显微镜可对间期核及染色体进行三维结构研究，精确检测杂交信号。构研究，精确检测杂交信号。食管癌细胞系食管

12、癌细胞系24色染色体色染色体mFISH核型分析核型分析组织切片间期染色体组织切片间期染色体荧光原位杂交荧光原位杂交食管癌细胞单条染色体涂，食管癌细胞单条染色体涂，同时特异位点定位同时特异位点定位BAC FISHFISH的应用的应用(1)基因定位与基因制图（基因定位与基因制图（gene mapping） ：加速了人类基因定位和基因制图的进程。(2)基因诊断基因诊断(gene diagnosis) 精确、直观、明了(3)间期细胞遗传学（间期细胞遗传学（interphase cytogenetics）(4)FISH在肿瘤生物学中的应用在肿瘤生物学中的应用 肿瘤细胞遗传学（肿瘤细胞遗传学（onco-c

13、ytogenetics）；）；基因定位：基因定位：FISH可用于分离出的癌基因与抑癌基因初步定位；病毒基因插入基因组部分的检测：病毒基因插入基因组部分的检测：虽然逆转录病毒以激活原癌基因为主，也有像腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白产物与抑癌基因蛋白产物相互作用而诱导细胞转化。但病毒基因特别是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因组。利用FISH可以检测到病毒整合到人基因组中的情况，对深入研究病毒致癌机理，以及检测、防治肿瘤均具有重要意义；基因的扩增与缺失：基因的扩增与缺失：原癌基因的激活与抑癌基因的失活是目前肿瘤研究的热点。已知原癌基因的激活方式有：突变、基因扩增、易位、病毒序列插入。抑癌

14、基因的失活方式有：点突变、基因缺失。FISH为研究基因的扩增和缺失提供了新的方法，能将基因扩增和染色体重复分开。菌落原位杂交菌落原位杂交 对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于存于4直至得到筛选结果。直至得到筛选结果。 液相杂

15、交液相杂交 核酸分子与核酸探针存在于杂交液中核酸分子与核酸探针存在于杂交液中 RNA酶保护分析法酶保护分析法 核酸酶核酸酶S1保护分析法保护分析法 待测RNA样品 单链DNA探针 液相杂交 DNA-RNA杂交双链 核酸酶S1（专一降解未杂交的单链） 酶解 杂交体系纯化 脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影 待测RNA样品 单链RNA探针 液相杂交 RNA-RNA杂交双链 RNA酶（专一降解RNA单链） 酶解 杂交体系纯化 脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影 核酸酶核酸酶S1保护分析法保护分析法RNA酶保护分析法酶保护分析法Western 杂交印迹法杂交印迹法(Western bloting) 检

16、测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤：主要步骤： 蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳电泳 蛋白质的电转移：蛋白质的电转移：NC膜膜 靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测* 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应靶蛋白于第一抗体（一抗）反应* 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应* 显色反应：酶促反应显色反应：酶促反应图3 p16、p21、PCNA、cyclin

17、 D1和cyclin E蛋白蛋白印迹杂交杂交结果 新的设备新的设备探针的标记探针的标记 探针的种类探针的种类 cDNA 探针、基因组探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、探针、寡核苷酸探针、RNA探针探针 标记物标记物 核素标记物（同位素标记）：核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等等 非核素标记物（非同位素标记）：非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地生物素、地高辛高辛、荧光素等、荧光素等DNA探针探针 荧光间接标记荧光间接标记DNA探针检测探针检测 地高辛标记的地高辛标记的RNA探针探针 探针标记方法探针标记方法 缺口平移法缺口平移法(nick translation) 随机引

18、物法随机引物法(random primer)：六核苷酸残：六核苷酸残基的引物基的引物 PCR标记法标记法 末端标记法末端标记法 探针的纯化探针的纯化基因芯片 利用核酸杂交的原理，应用于利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究的研究背景资料背景资料基因芯片（ ）就是利用点样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条探针。由于芯片上有序地排列着探针，因此也被称为微阵列（）。在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（或）就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应

19、核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。研究背景研究背景* * Craig VenterCraig Venter博士采用博士采用散弹法于散弹法于ScienceScience上发表上发表结果。结果。发展发展 早期微处理芯片技术早期微处理芯片技术 微电子平板印刷技术微电子平板印刷技术 20世纪中期世纪中期 Bains的反向分子杂交的反向分子杂交 90年代的代光引导合成技术和年代的代光引导合成技术和DNA压电压电打印打印/喷印技术及激光共

20、聚焦显微扫描技喷印技术及激光共聚焦显微扫描技术术什么是基因芯片？什么是基因芯片？基因芯片是将大量靶基因（或基因片段）有序地、高密度地点在玻璃片或硅片或塑料片上等载体上所形成的矩阵。将待侧样品用荧光染料标记制备成探针与芯片杂交，杂交信号用激光扫描仪检测，计算机分析检测结果，可获得类似与传统的点杂交的杂交数据，以达到快速、高效、高通量及平行性的分析生物信息的目的。基因芯片的特点：基因芯片的特点：1、高通量、高通量2、微型化、微型化3、自动化、自动化4、低成本、低成本5、高度并行、高度并行分类分类 根据介质划分：玻片、硅片、高分子凝根据介质划分：玻片、硅片、高分子凝胶、尼龙膜、微型磁球等。胶、尼龙膜

21、、微型磁球等。 根据制备方法：原位合成与合成点样。根据制备方法：原位合成与合成点样。 根据芯片上的探针划分：基因芯片和蛋根据芯片上的探针划分：基因芯片和蛋白芯片。白芯片。 根据芯片的结构和工作原理划分：微阵根据芯片的结构和工作原理划分：微阵列芯片和微流体芯片。列芯片和微流体芯片。基因芯片的用途：基因芯片的用途： 操作流程 （1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）；）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）； （2）靶基因样品的制备；）靶基因样品的制备； 靶基因的制备：靶基因的制备：RT-PCR （设实验组和对照组）（设实验组和对照组） 标记方法：分别进行荧光素标记如：标记方法：分别进

22、行荧光素标记如：Cy3和和Cy5 （3）生化杂交反应；）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似与常规的分子杂交过程基本相似 封闭封闭 预杂交预杂交 杂交杂交 洗脱洗脱 （4）杂交信号的检测与结果的分析）杂交信号的检测与结果的分析 激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析 技术流程示意图：技术流程示意图：基因芯片杂交基因芯片杂交基因芯片杂交图谱基因芯片杂交图谱2011年，公开发表的基因芯片学术论文已超过10000篇，参与基因芯片研发和应用的公司超过2000家，代表了现代生物技术最前沿的发展方向之一。目前全球基因芯片产业规模大约在70亿美元左

23、右，预计到2020年将达到200亿美元。产业主要集中在欧美发达国家市场主要集中在欧美发达国家市场，主要的应用领域包括科研、生物制药（主要应用于靶点筛选、毒理评估）、临床诊断(主要应用于遗传性疾病及病原体诊断)等。相对于发达国家，我国基因芯片产业仍处于起步阶段我国基因芯片产业仍处于起步阶段，未形成产业化，主要的瓶颈是下游用户较少，由于成本较高无法产生经济效益，短期内不能大规模推广。 众多政治家科学家和投资者认为基因芯片和相关产品产值有可能超过微电子芯片，成为本世纪最大的高科技产业，拥有巨大的商业潜力。1992年，Affymatrix公司Fodor领导的小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的

24、DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。1995年，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片。标志着基因芯片技术进入了广泛研究和应用的时期。 鉴于DNA芯片技术领域的飞速发展，美国科学促进会将DNA芯片评为1998年的十大科技突破之一，认为生物芯片技术将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。1998年年6月月29日美国宣布正式启动基因芯片计划。日美国宣布正式启动基因芯片计划。基因芯片的应用基因芯片的应用 用于基因转录水平的检测、基因组分析用于基因转录水平的检测、基因组分析和后基因组研究和后基因组研究 举例：举例：美国斯坦福

25、大学美国斯坦福大学Davis等用等用PCR法从外周血淋巴细胞法从外周血淋巴细胞cDNA文库中得到了文库中得到了1046种种cDNA片段，制成芯片，然后与热处理的片段，制成芯片，然后与热处理的T淋淋巴细胞和未处理的巴细胞和未处理的T细胞种提取的细胞种提取的mRNA反转录出的单链反转录出的单链cDNA片片段杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现段杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现17个差异表达的基个差异表达的基因，其中因，其中11个是被热诱导的，个是被热诱导的，6个是被热抑制的。经序列分析证个是被热抑制的。经序列分析证实，其中实，其中3个是未报导的新基因。个是未报导的新基因。扩展应用扩展应用1

26、. 基因表达水平的检测基因表达水平的检测2. 基因多态性与药物的应用基因多态性与药物的应用3. 基因诊断基因诊断4. 药物筛选药物筛选5. 加速中药的发展加速中药的发展6. 在环境科学领域中的应用（毒理芯片）在环境科学领域中的应用（毒理芯片）7. 在生物战剂和化学战剂侦测中应用在生物战剂和化学战剂侦测中应用 等等等等点样设备：点样设备：Telechem公司公司全新全新SpotBot Personal MicroarrayerBioRobot 9604： 此仪器是专为临床样品和细胞培养液设计的核酸自动纯化的分子生物学工作站。Ready-to-Print cDNA 系列，共计5278个人类基因，3

27、197个小鼠基因或者2727个大鼠基因（每个基因片断有3ug，分装在96孔板中）蛋白质芯片蛋白质芯片 指把制备好的蛋白质样品固定于经化学指把制备好的蛋白质样品固定于经化学修饰的玻片、硅片等载体上，蛋白质与修饰的玻片、硅片等载体上，蛋白质与载体表面结合，同时仍保留蛋白质的物载体表面结合，同时仍保留蛋白质的物化性质和生物活性。化性质和生物活性。是是。例如用于大量不同蛋白检测和表位分析的例如用于大量不同蛋白检测和表位分析的（也称（也称）。）。类型与制备类型与制备 制作方式：原位合成、点合成和光蚀刻术制作方式：原位合成、点合成和光蚀刻术 类型：蛋白质微阵列、微孔板蛋白质芯片、三类型：蛋白质微阵列、微孔

28、板蛋白质芯片、三维凝胶块芯片、芯片实验室维凝胶块芯片、芯片实验室操作操作样品的制备样品的制备标记标记检测检测微阵列酶联微阵列酶联免疫法免疫法 应用应用 表达物的筛选表达物的筛选 识别酶的底物和抑制剂识别酶的底物和抑制剂 样品的分离和分析样品的分离和分析 研究蛋白质和小分子的相互作用研究蛋白质和小分子的相互作用液相芯片检测系统液相芯片检测系统液相芯片技术是液相芯片技术是20世纪世纪90年代后期发展起来的被喻为后基因组时代的芯年代后期发展起来的被喻为后基因组时代的芯片技术。片技术。液相芯片技术将流式检测技术与芯片技术有机地结合在一起。液相芯片技术将流式检测技术与芯片技术有机地结合在一起。一方面大大延伸了流式检测平台，以微球体代替细胞作为反应载体，这一方面大大延伸了流式检测平台，以微球体代替细胞作为反应载体，这个相当开放的反应体系可进行蛋白、核酸等等生物大分子的检测，不仅个相当开放的反应体系可进行蛋白、核酸等等生物大分子的检测，不仅从细胞水平深入到分子水平，其检测范围也得到了前所未有的扩展；从细胞水平深入到分子水平，其检测范围也得到了前所未有的扩展；另一方面也使芯片技术取得重大的突破：在