基因工程基本操作的四个步骤

1、基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段基因

2、文库 基因组文库（某物种全部基因 ）部分基因文库（如:cDNA文库）1.1.基因文库基因文库2.2.基因文库的构建方法与目的基因的获得基因文库的构建方法与目的基因的获得鸟枪法：鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶与载体连接载入与载体连接载入受体细胞受体细胞（基因组文库）（基因组文库） 产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离( (直接分离法直接分离法) )( (一一) )从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因反转录法：反转录法： 以目的基因转录成的以目的基因转录成的信使信使RNAR

3、NA为模板，反转录为模板，反转录成互补的单链成互补的单链DNADNA，然后，然后在酶的作用下合成双链在酶的作用下合成双链DNADNA，从而获得所需的基，从而获得所需的基因。因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA杂交双链杂交双链( (单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA反转录酶反转录酶核酸酶核酸酶H H2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法与目的基因的获得DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA(DNA(目的基因目的基因) )（cDNAcDNA文库）文库）根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ： 根据已知蛋白质根据已知蛋白质的氨基

4、酸序列，推测的氨基酸序列，推测出相应的信使出相应的信使RNARNA序列，序列，然后按照碱基互补配然后按照碱基互补配对原则，推测出它的对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合以单核苷酸为原料合成目的基因。成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法与目的基因的获得上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺

5、点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的有时并分离出来的有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要很不稳定，要求的技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因思考思考: :为什么要构建基因文库为什么要构建基因文库? ?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗? ?PCR扩增仪扩增仪DNA双链复制的基本原理双链复制的基本原理

6、一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸dNTPdNTP一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA (DNA (含有目的基因含有目的基因) )温度控制温度控制方式方式：以：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增指数指数2 2n n过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板

7、在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（、退火（复性55-6055-60）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件条件：_

8、、 _、_ (_ (做启动子做启动子) )、 _._.前提条件：前提条件：原理原理：_方式方式：以：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果结果：选修选修1 P1 P6060多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA双链复制双链复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因2.2.基因文库的

9、构建方法与目的基因的获得基因文库的构建方法与目的基因的获得鸟枪法：鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶与载体连接载入与载体连接载入受体细胞受体细胞（基因组文库）（基因组文库） 产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离( (直接分离法直接分离法) )( (一一) )从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ： 根据已知蛋白质根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测出相应的信使出相应的信使RNARNA序列，序列，然

10、后按照碱基互补配然后按照碱基互补配对原则，推测出它的对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合以单核苷酸为原料合成目的基因。成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法与目的基因的获得 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件条件：_、 _、_ (_ (做启动子做启动子) )、 _._.前提条件：前提条件：原理原理：_方式方式：以：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果结果：选修选修1 P1 P6060多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特