基因工程与应用

1、 11前言众所周知，癌症是现今社会死亡率较高的疾病之一，不仅是因为治疗技术有限，更主要的是肿瘤难以被发现导致错过了最佳治疗时期，癌症如果能够早期发现，根治的机会大大增加。但是，目前世界上公认只有乳腺癌、结直肠癌、子宫颈癌、前列腺癌等几种癌症，可能在无症状的情况下，通过常规健康体检及普查能够早期发现。而日常我们看到的癌症，大多数都是因为出现了或多或少的临床症状而就医后被确诊的。事实上，通过健康体检发现的癌症不一定都是癌症早期，而即使接受了昂贵的仪器设备检查，也不能保证能早期发现所有癌症。荧光蛋白作为新一代生物源性荧光标记物质具有高效、稳定、无毒、易于检测等特性，也已广泛用于各种蛋白质、细胞器的标

2、记和特定基因表达研究。如果将这种荧光蛋白导入含有大量蛋白质的食物中（如大豆、鸡蛋、牛奶等），就可以通过人体对食物的消化、吸收、分布将荧光蛋白带入体内，肿瘤细胞增殖需要大量蛋白质，根据各部位荧光蛋白的含量可以确定各器官的健康状况。此方法不仅减少人们昂贵的仪器检查费用，更减少了人们在检查中所承受的痛苦，提高了肿瘤检测的精确度以及便于早期发现，有利于肿瘤疾病的治疗。 前言1一、设计目的31、癌细胞难以被发现32、癌症检查技术有限33、癌症检查费用昂贵3二、设计思路4三、设计步骤51、目的基因的获取52、基因表达载体的构建63、将目的基因导入受体细胞74、目的基因的检测和表达7四、设计流程81、目的基

3、因获取82、目的基因表达载体构建示83、将目的基因导入受体细胞94、重组细胞的筛选及鉴定9五、参考文献11一、设计目的1、癌细胞难以被发现早期肿瘤较小，尤其直径小于1厘米的微小肿瘤，常规体检难以查出，像胰腺癌、卵巢癌、纵隔肿瘤等生长部位隐蔽的肿瘤，也难以通过常规体检早期发现，而某些恶性程度很高的癌症，即使原发病灶很小，可能也已发生了血行播散或淋巴道播散。癌细胞是一种伴随着机体的衰老过程而难以避免的生理偏差，越到老年，细胞复制的次数越多，加上老年人自身的免疫监视、识别、清理系统等的功能弱化，出偏差的概率就越高。2、癌症检查技术有限癌症在目前的医学研究水平下，确实是一种比较难治的疾病，难的原因在于

4、，癌症早期没有征兆，80%的病人发现时已经是晚期了手，通过手术、放疗、化疗、生物治疗等多种治疗方式，也不一定能痊愈。3、癌症检查费用昂贵最常检查的是AFP和CEA，AFP结和B超可以检查原发性肝癌，CEA,对原发性结肠癌，胰腺癌、胆管癌、胃癌。食道癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系统肿瘤都有早期发现的帮助。正常到医院检测的手段如：CT，X线，活检，核磁共振等，最基本的费用是上千块，贵的可能上万。对于中、低等收入家庭，这是一笔不小的开销。如果将这种荧光蛋白导入含有大量蛋白质的食物中（如大豆、鸡蛋、牛奶等），就可以通过人体对食物的消化、吸收、分布将荧光蛋白带入体内，肿瘤细胞增殖需要大量蛋白质，根据各部位荧光

5、蛋白的含量可以确定各器官的健康状况且价格低廉方便。二、设计思路通过转基因的方法，提取的目的基因后，进行基因表达载体的构建，然后将目的基因导入大豆细胞中，进行目的基因的检测和表达。将含有红色荧光蛋白的大豆制成食物，当人们做身体检查时，通过使用这种食物，就可根据荧光蛋白在体内的分布情况和各部位含量的多少，判断各器官的健康状况。荧光大豆设计基本程序三、设计步骤1、目的基因的获取1、1目的基因选择红色色荧光蛋白是一种能发光的蛋白质，类似于示踪元素，荧光蛋白质可作为标签蛋白，标识生物体内蛋白质的位置，它照亮了人们以前看不到的世界。名称来源特点用途红色色荧光蛋白（RFP）深红色海葵（1）颜色鲜亮、穿透性强

6、、能在生物体稳定存在（2）从外界就可以明显看到这种深红色荧光蛋白质从动物肌肉组织深处发出的亮光，而同种处于肌肉组织深处的一般荧光蛋白质发出的光则几乎看不见够在生物体内稳定存在，同时能发出更明亮红光的蛋白质用于活体物内脏的深度成像，从而有助于研究人员在活生物体身上非侵入式地进行癌细胞发展和治疗过程的实时研究，使我们对癌症等疾病的发病过程有更深入的了解1、2获得目的基因方法获取目的基因的方法有从两种，一种是基因文库提取，另一种是人工合成法。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。在此使用的是基因文库提取法，然后将获取的目的基因扩增，使用PCR扩增技术。PCR技术扩增目的基因（1）原理：D

7、NA双链复制（2）过程：第一步：加热至9095DNA解链； 第二步：冷却到5560，引物结合到互补DNA链； 第三步：加热至7075，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。2、基因表达载体的构建2、1目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.2组成目的基因启动子终止子标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含

8、有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因3、将目的基因导入受体细胞 将目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。3.1常用的转化方法 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细

9、胞吸收DNA分子，完成转化过程。3.2目的基因的筛选重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。4、目的基因的检测和表达4.1检测首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。4.2表达最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原抗体杂交。有时还需进行个体生物学水平的鉴定。四、设计流程1、目的基因获取将从基因文库中获取的目的基因进行PCR扩增2、目的基因表达载体构建示在双向载体质粒pGAH

10、 的左边界(LB)和右边界(RB)之间插入氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和四环素抗性基因(Tetr), 并在两个抗性基因之间插入RFP 基因。RFP 基因前连接小亚基信号肽(或称转运肽)序列(rbcS tr), 后连转录终止子序列(NOS ter), 并在rbcS t r 前面连接35 S 启动子。该基因转录产物由小亚基信号肽引入到大豆中表达红色荧光。 HaeIII EcoRI Ampr35SprorbcStrRFPNOSterTetr目的基因表达载体构建示意图HindIII与EcoRI两种限制酶的切割位点3、将目的基因导入受体细胞将农杆菌EHA101 接种于含有50 ml Yeast Ext

11、 ract-B MediumYEB液体培养基(含有50 mg/L氨苄青霉素和150mg/L 的四环素)250 ml 的三角瓶中, 37 下振荡培养。当其菌体浓度达到A =0 .5 值时, 收集菌体用于转化。将无菌的大豆再生苗叶切片为3mm2左右, 与农杆菌EHA101 浸染30 min , 用滤纸吸去菌液, 并接种于MS 分化培养基上, 2天后转入双抗选择培养基(MS +10 mg/L氨苄青霉素+150 mg/L四环素+300 mg/L 羧卞西林钠)中培养, 并筛选出转基因植株。经多次无性繁殖及反复抗性筛选后获得的植株用于分子检测和抗盐性及生理分析和检测。4、重组细胞的筛选及鉴定目的基因重组后，主要有三种类型的细胞，非重组细胞、目的重组细胞和非目的重组细胞。常用的筛选方法有：利用载体所带筛选标记进行筛选、利用基因表达产物的方法、利用特异性核酸探针的方法进行筛选等方法。 三种重组细胞示意图因为在构建基因表达载体的时间，插入了氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和四环素抗性基因(Tetr)，所以选择利用抗生素抗性基因插入失活法进行筛选。 重组体的鉴定从大的方面来讲有这样四个方法，限制性酶切图谱法、Southern印记杂交法、基因产物鉴定、基因测序。本次试验中采Southern印记杂交法，对载体上是否插入的外源DNA片段进行分析，从而鉴定目的重组细胞。将我们最终得到的目的重组细胞进行培养得到