《现代生命科学实验指导》改版编写格式

1、现代生命科学实验指导（第二版）编写格式（征求意见）为进一步深化实验教学改革，提高实验教学质量，增强学生综合分析能力、实验动手能力、数据处理及查阅资料能力，培养学生的实践与创新能力,我们在原现代生命科学实验指导一书的基础上，对基础性、综合性、设计性实验进行整理、规范、充实和完善，进一步增强实验指导书的实用性、科学性，推动实验教学水平的提高。首先，明确基础性、综合性、设计性实验的界定标准；然后写出模板，再举几个实例，供大家参考，并征求意见。一、实验性质界定的标准1、基础性实验是指实验内容涉及本课程的基础知识的实验，该类实验的目的在于通过实验使学生掌握本课程的基本操作技能并深化学生对理论课程的理解。

2、2、综合性实验是指实验内容涉及本课程的综合知识或本课程相关课程知识点的实验。该类实验的目的在于通过实验内容、实验方法、实验手段的综合，牢固掌握本课程及相关课程的综合知识，培养学生综合处理问题的能力，达到能力和素质的综合培养与提高。3、设计性实验是指实验指导教师根据教学的要求提出实验目的和实验要求，并给出实验室所能够提供的实验仪器设备、器件、药品、试剂等实验条件，由学生运用已掌握的基本知识、基本原理和实验技能，自行设计实验方案、拟定实验步骤、选定仪器设备（或器件、试剂、材料等）、独立完成操作、记录实验数据、绘制图表、分析实验结果等。该类实验的目的在于培养学生的综合处理问题和综合设计能力，激发学生

3、的主动性和开拓创新意识。实验过程应充分发挥学生的主观能动性，引导学生独立思考，独立完成实验的全过程。二、各类实验编写模版基础性、综合性实验指导书内容模版实验名称：实验项目性质：所涉及的知识点：计划学时：一、实验目的二、实验原理三、实验用品四、实验步骤五、注意事项六、思考题设计性实验指导书内容模版实验名称：实验项目性质：设计性所涉及的知识点：计划学时：一、实验目的二、实验原理三、实验用品四、研究方案五、实验建议六、思考题三、各类实验范例1、基础性实验指导书范例实验五十三 果蝇唾腺染色体观察实验项目性质：基础性所涉及的知识点：染色体形态计划学时：2一、实验目的观察D.melanogaster的睡腺

4、染色体，练习果蝇幼虫解剖技术和果蝇唾腺染色体制片法。二、实验原理 唾腺染色体是处于体细胞同源染色体的配对状态，它们的巨大性，是由于重复分裂后的众多染色线没有分开的结果，因此又称为“多线染色体”。一般说来，多线染色体是处于永久性前期中的一种体细胞染色体配对形式。它普遍存在于双翅目昆虫某些物种的幼虫唾腺细胞内，是研究唾腺染色体常用的材料。三、实验用品1实验材料：果蝇幼虫。2实验药品与试剂 (1) 醋酸洋红 (2) 冰醋酸 (3) 盐溶液(0.7%的氯化钠) (4) 0.2mol/LHCl (5) 蒸馏水3、实验器材（1）双筒解剖镜 （2）显微镜 (3)镊子 （4）解剖针 (5) 载玻片 (6) 盖

5、玻片四、实验步骤1蝇种类的选择及培养 选取强壮的果蝇培养三龄幼虫，并进行低温处理，即25 培养，待有大量幼虫出现后，再转入3-5 的冰箱内冷处理24h，再转入20 温箱内培养，使幼虫充分发育。唾液腺的解剖挑选发育完全，身体肥大的三龄幼虫，置于滴加有l 滴生理盐水的载玻片上，在双筒镜下，分清幼虫的头和尾。左右手各执一根解剖针，左手的解剖针呈45°，固定在幼虫身体前端的1/3处（即中肠处）；右手持解剖针压住幼虫的口器即黑色小点处，水平往前移动，唾液腺便随之被拖出来（图2-5-5）。腺体位于食道两侧，中间夹有神经球。腺体拉出后，剔除杂质。注意：在拖取唾液腺时必须将幼虫浸在滴有l 滴生理盐水

6、的载玻片上拖，否则，唾液腺即使被完整地拖出来，由于缺少水分，也会因为干燥粘在玻片上而被破坏；固定的位置必须是在靠近头部的1/ 3 处，解剖针的角度只能在30°-45°左右，右手的解剖针必须水平向前移动。低渗处理 加人1-2 滴蒸馏水，使成为低渗液，处理8-10min。4杂质的剥离 以吸水纸小心吸去低渗液后，滴加0.2 mol/L的HCl 1-2滴，解离1-2 min 后，用解剖针轻轻拨动，脂肪等杂质便会和唾液腺自动分离。5染色 用滤纸条吸干盐酸溶液，再滴一滴清水或低渗液，约1min后用滤纸条吸干重复34次，即可洗净残留的盐酸，以免影响染色效果。用改良的石碳酸品红溶液，在室温

7、下染色510min。6压片 取一片干净的盖玻片和一个双面刀片，盖片时在盖玻片和载玻片间边缘处放一双面刀片，在盖玻片上用解剖针柄轻轻敲压，使盖玻片和载玻片间的液体流动，靠流动的力量将染色体臂伸展开，待将染色体完全压散后(没有红色)，将刀片取出，再用中指轻轻压片，使细胞充分分散。7观察 图2-5-5 果蝇幼虫剖面图a肛门，h后肠，g盲囊，mi 中肠，i 唾腺原基，mh 大鳃钩，o 食道，ph 咽头，pr 前胃，sd 唾腺分泌管，sq 唾腺，mt 马氏管（图来自文献1）图2-5-6 果蝇唾液腺解剖示意图（图来自文献6）图2-5-7 果蝇唾液腺 图2-5-8 果蝇唾腺染色体核型五、注意事项1注意拉取唾

8、腺时一定要慢。2观察要仔细。六、思考题结合实验绘制你所看到的图像。2、综合性实验指导书范例实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质实验项目性质：综合性所涉及的知识点：聚丙烯酰胺凝胶的制备，电泳技术，蛋白质的理化性质计划学时：6一、实验目的1了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理； 2掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。二、实验原理在生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法。

9、聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子量大小不同的物质。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N四甲基乙二胺（简称TEMED）。通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内完成。（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加入TEMED加速反应。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二

10、大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；  凝胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）。浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。因此，样品分离效果好，分辨率高。SDS即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别

11、降低仍至消除。与此同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋于一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异，仅仅取决于蛋白质的分子量。另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂 （巯基乙醇）存在下，蛋白质分子内二硫键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。本实验采用化学聚合法制胶，进行不连续的凝胶电泳，并用考马斯亮蓝快速染色，以分离和鉴定大肠杆菌菌体、发酵液中和纯化的蛋白产物。三、实验用品1试剂（(全班分两大组，每组配一

12、份，如15组一份，610组一份)（1）30% 的凝胶贮备液：ACR 30g + Bis  0.8g 溶于 100 mL去离子水中，用3号新华滤纸过滤至棕色瓶中，4 避光贮存（1）。（2）3mol/L Tris-buffer,pH8.9：  Tris base 36.6 g + 1 mol/L  HCl 48 mL + ddHO 至100 mL）（3）0.5mol/L Tris-HCl, pH6.8 :  6.05g Tris base 溶于40mL ddHO中，加1mol/L HCl 48mL, 加水补至100mL.（4）5×Tris-甘氨酸电

13、泳buffer（pH8.3):（配1L）  Tris-base 15.1g + 甘氨酸94g + 5g SDS + H2O至1L（用时稀释5倍）。（5）10% SDS:：称10克SDS溶解于100mL去离子水中，贮存于室温中。（6）TEMED（四甲基乙二胺）：浓度10%，20 mL (全班共用)，4保存。（7）10% AP（过硫酸铵）：10 mL，新鲜配制，分装至1.5mL 离心管中，20保 存待用（2）。 （8）样品溶解液：内含1% SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL缓冲液。 

14、60;  * 先配制0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液：称Tris 0.6g ，加入50 ml重蒸水，再加入约3 ml 1mol/L HCL,调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100 ml    *按下表配制样品溶解液： 表1 样品溶解液的配制试剂SDS巯基乙醇溴酚蓝蔗糖0.5mol/LTris-HCl加重蒸水至最后总体积为体积100mL0.1mL2mg4g2mL10mL    *如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。    *或配制2 X SDS样品缓冲

15、液：            100mmol/L    Tris-HCl (pH6.8)            200mmol/L    DTT                 4%

16、           SDS                 0.2%        溴酚蓝         20%      &

17、#160;  甘油    必要时加入少量（1%）巯基乙醇。（9）考马斯亮蓝染色液(3)：0.05 g考马斯亮蓝R250溶于25 mL异丙醇里，加11 mL冰醋酸+H2O 至110 mL，用滤纸过滤除去不溶物。（10）0.1%溴酚蓝指示剂（全班共用）（11）脱色液：75 mL冰乙酸 + 50 mL甲醇 + 875 mL H2O（若只配500 mL，各物质减半）。2器材  电泳仪   垂直板电泳槽，电泳 微量进样器（50L） 染色/脱色摇床。四、实验步骤1胶板模型的安装：在干净的凹形玻璃板的三条边上放好塑料条（有些型号的电泳板已

18、有固定的隔板），然后将另一块玻璃板压上，用夹子夹紧（或装在制板模型中），在两块板之间滴上热融的10 琼脂糖凝胶封边（4）。2分离胶的制备10 ml，可供两块板( 11cm x10 cm)使用表2 分离胶的制备成分浓度6%10%12%15%20%无离子水5.34.03.22.31.230%凝胶液2.03.34.05.06.73mol/LTris-HCl（pH8.9）2.62.62.62.62.610%SDS0.10.10.10.10.110%APS(uL)3030303030TEMED(uL)2020202020总计(mL)1010101010用手轻摇混匀, 小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中

19、，为浓缩胶留足够的空间（2.5cm）,轻轻在顶层加入几毫升去离子水覆盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全，整个过程约需30分钟（25室温）。3浓缩胶的制备：先把已聚合好的分离凝胶上层的水吸去，再用滤纸吸干残留的水液。   按下列配方制备各种体积的浓缩胶溶液：表3 浓缩胶的制备成分配比无离子水3.45.56.810.230%凝胶液0.831.31.72.530.5mol/LTris-HCl（pH6.8）0.651.01.251.8810%SDS0.050.080.10.151

20、0%APS(uL)4080100120TEMED(uL)10121520总计(mL)581015混合后将其注入分离胶上端，插入梳子，小心避免气泡的出现。4在浓缩胶聚合的同时，将蛋白样品与2x样品缓冲液等体积混合，置沸水或微量恒温器（100）中加热3分钟，马上插入冰上冷却待用。5浓缩胶聚合完全后，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均加入1X电泳缓冲液，小心地拔出梳子，用移液器冲洗梳孔，检查有无漏，并驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。6按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，所加样品混合液体积要根据样品蛋白浓度而定，一孔加一个样品，同时用已知分子量的标准蛋白作对照。本实验系统中需要分离鉴定

21、的是纯化的GFP蛋白，点样样品和次序包括：                         蛋白Marker                    &

22、#160;    pUC18细菌总蛋白                        pGFP未诱导总蛋白                   

23、60;    pGFP加Glu及IPTG诱导总蛋白pGFP加IPTG诱导破菌后上清总蛋白                        层析时的穿流峰（杂蛋白）               

24、         层析时的洗涤峰I                        层析时的洗涤峰II                

25、;       GFP对照 7电泳：开始时电压为58V/cm（约100V）凝胶，待染料浓缩成一条线开始进入分离胶后，将电压增到1012V/cm（约180V）凝胶，继续电泳直到染料（溴酚蓝）抵达分离胶底部，断开电源。8剥胶：取下胶板，从底部一侧轻轻撬开玻璃板，用手术刀切去浓缩胶，并切去一小角作记号。9.固定及染色：取下凝胶放入大培养皿，用考马斯蓝染色液染色并固定，最好放在摇床缓慢旋转1-2小时。10脱色：先用水洗去染料，再放入脱色液中浸泡，更换脱色液3-4次，约4-8小时或过夜。11将脱色后凝胶中的蛋白质分离色带照相或干燥，也

26、可无限期地用塑料袋封闭在含20%甘油的水中。五、注意事项1丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺具有神经毒性，因此称量时要戴手套。两者聚合后即无毒性，但为避免接触少量可能未聚合的单体，所以建议在配胶和制板过程中都要带上手套操作。另外，配好的溶液之所以要避光保存，是因为此溶液见光极易脱氨基分解为丙烯酸和双丙烯酸。2过硫酸铵极易吸潮失效，因此要密闭干燥低温保存。配好的10过硫酸铵要分装冷藏。3考马斯亮蓝R-250(三苯基甲烷）染色: 每分子含有两个SO3H 基团，偏酸性，结合在蛋白质的碱性基团上。与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色。检测灵敏度约为0.20.5ug。也可用银染色：将蛋白带上的硝酸银还原成金属银、以使

27、银颗粒沉积在蛋白带上。此法比考马斯亮蓝灵敏两个数量级，但步骤较复杂。4制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作。有些型号的电泳板可在模型中直接安装，免去了封边和拆边的麻烦，还可以同时制备多块凝胶。5AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。为避免过快聚合，可将加了催化剂的凝胶先放在冰中。 6加热使蛋白质充分变性。7用移液器冲洗梳孔可将空中的凝胶除去，以免点样孔不平齐或影响蛋白样品的沉降。8两玻璃板间凝胶底部的大气泡可阻断电流，因此必须除去。9总量一般不超过20l，如果点

28、样量太多溢出梳孔，就会污染旁边泳道。要根据样品浓度来加样品溶解液。每点一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。10电泳时间要依据所用电压及待测蛋白分子量大小而定。11电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致，不能在凹形板双耳处撬，也不能用死力弄坏玻璃板。12考马斯亮蓝染色液盖过凝胶即可，染色后染色液要回收，可重复使用多次。13脱色过夜可使背景更干净，谱带更清晰。六、思考题1就实验中出现的各种问题进行分析讨论。2在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?3在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用。4根据下式计算标准蛋白和待测

29、样品的电泳迁移率，然后以标准蛋白的相对迁移率为横坐标，其分子量的对数为纵坐标作标准曲线图，根据标准曲线图准确计算待测蛋白的分子量。粗略估计待测蛋白分子量的方法是直接根据凝胶上的分子量标准进行估算。5为什么样品电泳前要高温加热？ 6进行凝胶电泳时应如何选择样品点样，设置对照？3、设计性实验指导书内容范例实验 蛋白质的沉淀及变性实验实验项目性质：设计性所涉及的知识点：蛋白质的理化性质计划学时：2一、实验目的1初步学会实验设计的思路和过程，自己设计出实验方案并完成。2了解蛋白质沉淀的因素，掌握沉淀反应的操作。3了解蛋白质变性与沉淀的关系，并能够区分可逆沉淀与不可逆沉淀作用。二、实验原理在水溶液中的蛋

30、白质分子由于表面生成水化层和双电层成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。(1) 可逆的沉淀反应：此时蛋白质分子的结构尚未发显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解在原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇(或丙酮)短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。(2) 不可逆沉淀反应：此时蛋白质分子内部结构发生大改变，蛋白质常因变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶

31、液稳定的条件仍然存在 (如电荷)并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。三、实验用品1器材（1）试管；（2）试管架；（3）容量瓶；（4）烧杯。 2试剂 (1) 蛋白质溶液：5卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液(新鲜鸡蛋清：水1：9) (2) pH 4.7醋酸醋酸钠的缓冲溶液： (3) 3硝酸银溶液； (4) 5三氯乙酸溶液； (5) 95乙醇； (6) 饱和硫酸铵溶液； (7) 硫酸铵结晶粉末； (8) 0.1mo1/L盐酸溶液 ； (9) 0.1mo1/L氢氧化钠溶液； (10) 0.05mo1L碳酸钠溶液； (11) 0.1mo1/L醋酸溶液； (12) 甲基

32、红溶液； (13) 2氯化钡溶液。 四、研究方案判断沉淀类型选择沉淀因素选择材料五、实验建议1每步沉淀反应都应设计出相应的方案判断是否可逆，能正确区分可逆沉淀和不可逆沉淀作用及沉淀与变性之间的关系。2实验结束后可根据实验现象和结果，提出超出本实验所提供器材和试剂的实验方案，并推测预期的结果，从而加深对本实验的理解。六、思考题 维持蛋白质胶体稳定性的因素是什么？ 【附：原始实验 蛋白质的沉淀及变性实验实验项目性质：基础性所涉及的知识点：蛋白质的理化性质计划学时：2 一、实验目的 1加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3了解蛋白质变性与沉淀的关系。 二、实验原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。(1) 可逆的沉淀反应：此时蛋白质分子的