酶联免疫吸附实验学习教案

1、会计学1酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验第一页，编辑于星期二：十点 十三分。 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法 了解其他免疫标记技术 一、实验目的第1页/共43页第二页，编辑于星期二：十点 十三分。第2页/共43页第三页，编辑于星期二：十点 十三分。是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。免疫标记技术（immunolabelling technique）第3页

2、/共43页第四页，编辑于星期二：十点 十三分。免疫标记技术 =免疫标记技术的主要特点：高度特异性、高度灵敏性第4页/共43页第五页，编辑于星期二：十点 十三分。 免疫标记技术放射物标记技术 酶标记技术 免疫荧光技术 其他标记技术酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术第5页/共43页第六页，编辑于星期二：十点 十三分。是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。 Ag + AbE AgAbE + 底物 呈色反应酶免疫技术(enzyme immunoassay)第6页/共43页第七页，编辑于星期二：十点

3、 十三分。酶联免疫吸附试验ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）第7页/共43页第八页，编辑于星期二：十点 十三分。第8页/共43页第九页，编辑于星期二：十点 十三分。ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。第9页/共43页第十页，编辑于星期二：十点 十

4、三分。常用酶及其底物1.辣根过氧化物酶(HRP)常用底物：(1)邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。(2)四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性, 但水溶性差。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为 450nm。2.碱性磷酸酶(AP)常用底物 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性较HRP差，且价高，故应用不如HRP普及。peroxidase (POD) 第10页/共43页第十一页，编辑于星期二：十点 十三分。Colorimetric ELISA Substrates 第11页/共

5、43页第十二页，编辑于星期二：十点 十三分。第12页/共43页第十三页，编辑于星期二：十点 十三分。第13页/共43页第十四页，编辑于星期二：十点 十三分。第14页/共43页第十五页，编辑于星期二：十点 十三分。第15页/共43页第十六页，编辑于星期二：十点 十三分。第16页/共43页第十七页，编辑于星期二：十点 十三分。第17页/共43页第十八页，编辑于星期二：十点 十三分。乙肝病毒存在三对抗原抗体系统1.即表面抗原（HbsAg）和表面抗体（抗-HBs）、2.e抗原（HBeAg）和e抗体（抗-HBe）、3.核心抗原（HBcAg）和核心抗体（抗-HBc） 因核心抗原主要存在于肝细胞中，血清中不

6、能表达，检测困难，故只能检测二对半而不能检测三对，所以称为二对半。 第18页/共43页第十九页，编辑于星期二：十点 十三分。实验材料1.HBsAg诊断试剂盒2.HBsAg抗原（阳性对照），阴性血清，待检血清第19页/共43页第二十页，编辑于星期二：十点 十三分。微孔条已经包被HBsAb1、编号：微孔条按顺序编号。2、加样：分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul， 空白对照。3、加入酶结合物：每孔中加入酶结合物50ul，空白对照孔不加，轻拍混匀。4、温育：贴上胶纸，37温育30分钟。5、洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完往后扣干（每次保持30-60秒的浸泡时间）。6、显色：每孔加底物A、

7、B各50ul，轻拍混匀，封口，37暗置10-15分钟。7、终止：每孔加终止液50ul，轻拍混匀。8、测定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并记录结果，读数在加终止液10分钟内完成。第20页/共43页第二十一页，编辑于星期二：十点 十三分。第21页/共43页第二十二页，编辑于星期二：十点 十三分。第22页/共43页第二十三页，编辑于星期二：十点 十三分。自习第23页/共43页第二十四页，编辑于星期二：十点 十三分。在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。特

8、别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定 。第24页/共43页第二十五页，编辑于星期二：十点 十三分。 包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。 对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗原并非要求十分严格，一般能用于补体结合试验的可溶性抗原均可用于ELISA。 对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种

9、动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。第25页/共43页第二十六页，编辑于星期二：十点 十三分。血清、血浆或其他体液，均可作为ELISA的试验样品（标本）。但应注意分离血清时，血液要求放置室温中凝固收缩，不宜置冰箱（4）中凝固，否则会使大部分IgM和少量IgG丧失活性。关于人血清在保存过程中抗体的稳定性报导尚不多。但一般认为作ELISA血清最好要新鲜，若要贮藏，必须少量分装保存于低温冰箱，并防止反复冻融。血浆可用肝素毛细管法采血，而血清可用滤纸片法采血。第26页/共43页第二十七页，编辑于星期二：十点 十三分。在E

10、LISA中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合物，此为进行ELISA检测的关键试剂。常规使用ELISA法的主要问题是能够简便地制备酶结合物，而此种制备好的酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。第27页/共43页第二十八页，编辑于星期二：十点 十三分。加入牛血清白蛋白（BSA）和吐温20抑制非特异性蛋白的竞争性吸附作用。它们有良好的封阻作用第28页/共43页第二十九页，编辑于星期二：十点 十三分。第29页/共43页第三十页，编辑于星期二：十点 十三分。(1) 任意确定一个时间，如20分钟或30分钟终止反应，测定被检标本和阳性参考标本的O.D值。这样所得的数据要进行校

11、正，校正可按下列公式： 校正后O.D绝对值=被检标本的O.D值*（1.0/阳性标本的O.D值）(2) 制备好一批酶结合物后预试时间，在反应温度固定时，当阳性参考血清O.D值达到1.0时终止反应，记录这个时间，如30分钟，以后用本批酶结合物测定待检样品时都采用同一时间终止反应，这个办法不需要校正，比较方便。第30页/共43页第三十一页，编辑于星期二：十点 十三分。 ELISA的试验结果可用肉眼观察颜色反应的深浅作出判断，也可用分光光度计作精确测定。当然,后者更为正确。而肉眼观察更为简便，而且也有一定正确性。 不论用哪种方法判定结果，每次都要有阳性和阴性参考血清作对照，这样可以消除一些外界的影响因

12、素。第31页/共43页第三十二页，编辑于星期二：十点 十三分。记录结果有下列几种方法：1、“+”或“-”：所有超过规定的O.D值（如O.D，0.4）的标本均属阳性，此规定O.D值是根据事先测定大量阴性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以一组阴性标本O.D平均值加23个标准差作为阳性阈值。 2、直接以O.D值来表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。 3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该标本的滴度。第32页/共43页第三十三页，编辑于星期二：十点 十三分。第33页/共43页第三十四页，编辑于星期二：十点 十三分。所用仪器如吸管、烧杯试管都要清洁，用于酶结合和底物的吸管和容器一定要分开。试剂要求标准化第34页/共43页第三十五页，编辑于星期二：十点 十三分。第35页/共43页第三十六页，编辑于星期二：十点 十三分。CEA的敏感性较低，目前尚不能用于常规诊断第36页/共43页第三十七页，编辑于星期二：十点 十三分。第37页/共43页第三十八页，编辑于星期二：十点 十三分。淋球菌、假丝酵母菌等的抗体，还可用于破伤