聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质汇总

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质Po1yacrylamide gel electrophoresis实验原理采用不连续系统（即缓冲液成分、pH 及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。（参看理论部分）仪器设备1 .电泳玻管内径0.5 cm,长12 cm2 .小胶管、玻棒直彳至0.7 0.8cm,长1.5-2 cm3玻璃滴管、吸管、毛细滴管（灌胶用）4.微量加样器（50u1）（上样用）5桑玻氏管或灯泡瓶6真空泵7滤纸、剪刀8电泳槽、青霉素瓶塞（有孔）、竹筒9 .电泳仪（50mA、400V以上）10 .

2、注射器（5m1剂长针头（剥胶用）11 培养皿试剂1 .丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）: 一般可用分析纯（或标准纯）的Acr利Bis, 无需进一步提纯。但工业用的 Acr利Bis必需提纯或重结晶后才能应用。Acr 的重结晶：将Acr 溶于50氯仿中（70克升），趁热过滤，冷却至-20结晶，冷却的布氏漏斗过滤收集结晶，用冷氯仿淋洗，将结晶真空干燥。纯化的Acr水溶液的pH值在4.95.2,只要pH变化不大于0.4pH单位，就可使用。必要时可反复重结晶。Bis重结晶：12克Bis溶于4050c丙酮1升中，趁热过滤。凉后置-20C结晶，过滤或离心收集结晶。用冷丙酮洗涤，真空干燥。Acr和

3、Bis的贮存：固体Acr和Bis应贮存棕色瓶中，在干燥、低温和暗处保存，并 注意避免超声波、T -辐射和自然光的照射，（因可引起Acr自身聚合而失效）。Acr和Bis 贮存液，由于水解生成丙烯酸和NH 3而失效，贮存于4冰箱可延缓水解，但也只能保存 1 2月。Acr 利 Bis 是神经性毒剂，同时对皮肤有刺激作用。操作时应予以注意防护，大量操作（如纯化）时应在通风柜中进行，并避免吸入尘埃。2 TEMED- 四甲基乙二胺，避免冰箱保存。3过硫酸铵（不能潮解，否则不能用）4染色液：用0.05N NaOH 配制0.1溴酚兰液5洗脱液：7醋酸6其他试剂：见下表贮存液的配制按表 1 配制各贮存液置冰箱中

4、贮存，可放1 2 月（但过硫酸铵液贮存冰箱不能超过一周） 。表 1 贮存液及工作溶液的配制贮存液100ml溶液中的含量PH工作溶液配制的体积比11N HCl48.OmlTris 36.6 克TEMED0.23ml8.9分离胶制备：1份1号，2份2号，1份水；抽气后加入4份3号凝胶浓度 7%pH 8.92Acr 28.0 克Bis0.725克3过硫酸俊0.14克41N HCl48.OmlTris 5.98 克TEMED0.46ml6.7浓缩胶制备：1份4号，2份5号抽气后加入4份6号凝胶浓度 2.5%pH 6.75Acr10.0 克Bis2.5 克6蔗糖40.0克7电泳槽缓冲液：Tris 0.6

5、0 克甘氨酸2.88克8.3用时可稀释10倍500ml可供12根电泳管实验操作1 .每人取电泳管1支，标好号码，玻棒堵住底部，加12滴40%蔗糖于底端。（与橡皮接触部分凝胶不易聚合）。2 .分离胶制备：10人一组。吸取：1号 平2号 4ml在桑玻氏管中混匀，用真空泵抽气至无气泡为止。水 2ml抽气后加3号8ml,混匀备用（可灌胶12支）3 .用玻璃滴管灌胶于电泳管中，高约 8cm,然后在距胶面约1cm处，沿玻管壁缓 缓加入3-5mm高的水层（注意：不要打乱凝胶液面，切忌加入的水呈滴状坠入！），垂直静置凝胶让它进行聚合反应。聚合时可见原来加入水层出现的界面逐渐消失（因相互扩散），继又出现界面时，

6、表明凝胶已经聚合，再静置 15分钟使之聚合完全（应在3A60 分钟内聚成）。4 .样品液制备：血清1-2迎40%蔗糖 1需于一小试管中混匀备用0.05%g酚兰1滴5 .待分离月$成胶后（重新出现界面15分钟）用滤纸条吸干上层覆盖水6 .浓缩胶制备，10人一组。吸取：4号1m5号？mi在桑玻氏管中混匀，真空泵抽至无气泡为止。6 号 4ml抽气后加3号1ml,混匀备用。7 .用玻璃滴管灌浓缩胶于分离胶上，高约 11.5cm,然后小心覆盖蒸储水高约 0.5cm,垂置放置，待其成胶。8 .待浓缩胶成胶后，用滤纸条吸干上层覆盖水，拔去底端玻棒塞，用滤纸条吸干 蔗糖液，将胶管套在橡皮塞中，并装至电泳槽内，

7、然后倒入下槽电泳缓冲液，并用缓冲 液灌满胶管底部的空隙，排净空气（否则影响电流通过）。9 .上样：倒入上槽电泳缓冲液，用电泳缓冲液小心灌满玻管上端以排出空气。然 后用微量加样器吸样品液50ul,加在浓缩胶上。710 .电泳：上槽一一负极 下槽一一正极&俄摄.电极相3LJJ T* ;二 二二一一二一一一 二一二二二8!冲渔电泳玻瑶管下电机扪缓冲液净水入口一正极注：下电极槽可设计为夹层，需要时可通入冷水以降温电流：开始三分钟1.5mA/管三分钟后 2.5mA/管股情况可维持4毫安/管，电流太大会产热造成升温，使分离失败，（必要时应进行有效的冷却，如用冷水冷却或在低温室进行电泳）。电泳过程中

8、一般要求电流保持稳定。电泳与所用缓冲液和样品有关，一般可根据指示染料的迁移来决定，如指示染料已迁移至凝胶柱的下端附近或已迁至管长达3 4 距离时，即可停止电泳。关闭电源。取出玻管。缓冲液可以再行使用，但上下槽缓冲液不能混合或互换,因下槽中混有催化剂及氯离子。如换作上槽液，将影响电泳结果。11 凝胶取出（或剥胶）。电泳毕，取下电泳玻管，用一长针头注射器（针头长约68厘米），吸满蒸储水为润滑剂，把针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边压入水，一边使针头慢慢呈螺旋式推进，靠水流压力和润滑力将玻管内壁和凝胶分开。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。一般剥胶是从浓缩

9、胶端开始。剥胶时的要点是不要损伤凝胶柱表面。12固定和染色：固定：为了防止凝胶内分离成份扩散需进行固定，将剥出的凝胶柱浸泡在7乙酸或 1 5三氯醋酸的水溶液中数分钟即可，也可在染色的同时进行固定。本实验采取0.1溴酚兰碱性液直接染色，把胶剥至大试管中，加染色液染色5 分钟，染色液回收。用洗脱液（7醋酸）漂洗脱色，去除凝胶中非特异性吸附的染料，让背景呈浅色或无色，以使区带清晰，和便于定量分析（光密度计扫描测定）。13观看结果，描出血清电泳区带图谱，确定清蛋白有无异常。注意事项 备好玻管，加蔗糖后，要观察漏不漏，如漏则应换管。 灌胶时，管内应无气泡。胶面覆盖水时，要轻、慢，不能冲动界面。 灌完胶后，玻管要垂置放置