混合系列蛋白激酶样结构域MLKL通过磷酸化RIP3引发坏死性的膜破裂

1、程序性细胞死亡在多细胞个体的成长发育过程中扮有重要作用，程序性细胞死亡在多细胞个体的成长发育过程中扮有重要作用，主要分为两种途径主要分为两种途径凋亡和坏死，它们有着不同的形态学和生物化凋亡和坏死，它们有着不同的形态学和生物化学变化。学变化。凋亡主要表现为细胞体积缩小、核膜破裂、凋亡主要表现为细胞体积缩小、核膜破裂、DNA降解为约降解为约180-200bp的整数倍、并最终形成胞膜包被的凋亡小体，很快被巨噬细胞的整数倍、并最终形成胞膜包被的凋亡小体，很快被巨噬细胞和邻近细胞所吞噬。这些凋亡过程中形态学和生物化学的变化主要由和邻近细胞所吞噬。这些凋亡过程中形态学和生物化学的变化主要由一类半胱氨酸蛋白

2、酶一类半胱氨酸蛋白酶caspases执行。这些蛋白酶通过外在的死亡诱导执行。这些蛋白酶通过外在的死亡诱导信号激活，如肿瘤坏死因子受体或信号激活，如肿瘤坏死因子受体或Bcl-2家族蛋白，它们可使原来位于家族蛋白，它们可使原来位于线粒体膜间隙的蛋白质释放到胞浆，其中一种释放细胞色素线粒体膜间隙的蛋白质释放到胞浆，其中一种释放细胞色素C，与胞，与胞浆中的浆中的Apaf-1结合后激活结合后激活caspases。肿瘤坏死因子（肿瘤坏死因子（TNF）还可诱导细胞坏死，表现为细胞肿胀、胞内）还可诱导细胞坏死，表现为细胞肿胀、胞内细胞器变形或肿大、细胞细胞器变形或肿大、细胞ATP含量减少、细胞膜破裂。这种形式

3、的坏死含量减少、细胞膜破裂。这种形式的坏死,又称为又称为necroptosis，需要受体互作的蛋白激酶，需要受体互作的蛋白激酶RIP1、RIP3的激活。研究的激活。研究采用采用RIP3敲除的小鼠证实这种形式的细胞死亡对于应答微生物感染和炎敲除的小鼠证实这种形式的细胞死亡对于应答微生物感染和炎症介导的组织损伤具有重要意义。症介导的组织损伤具有重要意义。RIP3如何引发细胞坏死以及该途径是否自然运行在人类组织中是我如何引发细胞坏死以及该途径是否自然运行在人类组织中是我们理解细胞坏死面临的两大难题。们理解细胞坏死面临的两大难题。RIP1, RIP3以及以及MLKL相互结合形成相互结合形成一个信号复合

4、体，被称作一个信号复合体，被称作“necrosome”。 且且MLKL激酶结构域的激酶结构域的357位位的苏氨酸和的苏氨酸和358位的丝氨酸（人源）在细胞程序性坏死被启动后被位的丝氨酸（人源）在细胞程序性坏死被启动后被RIP3磷磷酸化。酸化。MLKL是拥有激酶结构域（与是拥有激酶结构域（与RIP3结合）但无激酶功能的假激酶。结合）但无激酶功能的假激酶。MLKL敲除的小鼠被证实与敲除的小鼠被证实与RIP3敲除的小鼠对细胞坏死具有相似的抵抗敲除的小鼠对细胞坏死具有相似的抵抗能力。但能力。但MLKL磷酸化导致细胞坏死的机制目前尚不清楚。磷酸化导致细胞坏死的机制目前尚不清楚。在当前研究中，我们开发了特

5、异性检测人类在当前研究中，我们开发了特异性检测人类MLKL蛋白在细胞坏蛋白在细胞坏死途径中第死途径中第357位苏氨酸和位苏氨酸和358位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体。通过一位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体。通过一系列的生化试验，我们发现系列的生化试验，我们发现necrosome从胞浆向质膜和细胞器膜上转位，从胞浆向质膜和细胞器膜上转位，这种转变使这种转变使MLKL在磷酸化驱使的聚合后获得与脂质直接结合的能力。在磷酸化驱使的聚合后获得与脂质直接结合的能力。一旦这些变化发生在膜上，聚合的一旦这些变化发生在膜上，聚合的MLKL将形成膜通透性孔道，破坏将形成膜通透性孔道，破坏膜的完整性，引起细胞坏死。膜的完整性

6、，引起细胞坏死。 RIP1, RIP3RIP1, RIP3以及以及MLKLMLKL相互相互结合形成一个细胞坏死复结合形成一个细胞坏死复合体合体 “ “necrosome”necrosome”；MLKLMLKL激酶结构域的激酶结构域的T357/S358T357/S358位被位被RIP3RIP3磷酸化；磷酸化；磷酸化的磷酸化的MLKLMLKL从单体状态从单体状态向寡聚体状态转化；寡聚向寡聚体状态转化；寡聚化的化的MLKLMLKL结合磷酸肌醇和结合磷酸肌醇和心肌磷脂心肌磷脂, ,整个复合体从细整个复合体从细胞质转移到细胞膜和细胞胞质转移到细胞膜和细胞器膜上，并在这些膜结构器膜上，并在这些膜结构上形成

7、通透性孔道，破坏上形成通透性孔道，破坏膜的完整性，引起细胞坏膜的完整性，引起细胞坏死。死。lRIP3 激酶对激酶对MLKL T357/S358 位位的磷酸化驱使的磷酸化驱使MLKL形成寡聚物；形成寡聚物；lMLKL 寡聚物从胞浆易位到寡聚物从胞浆易位到 细胞器膜细胞器膜和质膜上；和质膜上；lMLKL 寡聚物在细胞坏死过程中寡聚物在细胞坏死过程中直接直接破坏细胞膜的完破坏细胞膜的完整性；整性；lMLKL 磷酸化发生在药物引起的肝损伤病人活检组织磷酸化发生在药物引起的肝损伤病人活检组织中。中。1. MLKL磷酸化是细胞坏死的标志；磷酸化是细胞坏死的标志；2. 磷酸化的磷酸化的MLKL在细胞坏死过程

8、中易位到膜部分在细胞坏死过程中易位到膜部分；3. Necrosomes复合体在细胞坏死过程中转移到质膜和细胞器膜复合体在细胞坏死过程中转移到质膜和细胞器膜上；上；4. MLKL在细胞坏死过程中形成寡聚体在细胞坏死过程中形成寡聚体；5. MLKL结合磷脂和脂质体结合磷脂和脂质体；6. MLKL通过在膜上形成通透性孔道引起膜泄漏和细胞坏死通过在膜上形成通透性孔道引起膜泄漏和细胞坏死；7.药物引起的肝损伤病人活检组织中检测到药物引起的肝损伤病人活检组织中检测到MLKL磷酸化信号。磷酸化信号。 图图A A：采用采用MLKLMLKL磷酸特异性抗体检测磷酸特异性抗体检测MLKLMLKL在细胞坏死过程中的磷

9、酸化情况在细胞坏死过程中的磷酸化情况（HT-29HT-29细胞处理细胞处理8h8h）；）；1-71-7孔道为细孔道为细胞坏死诱导物，胞坏死诱导物，D D：二甲基亚砜；：二甲基亚砜；T T：TNF-TNF-；S S：Smac Smac 类似物；类似物；Z Z：Z-Z-VAD-fmkVAD-fmk；文献表明；文献表明 Smac Smac 类似物可类似物可以刺激细胞自分泌以刺激细胞自分泌TNF-TNF-。下图下图为为HT-29HT-29细胞采用不同的细胞坏细胞采用不同的细胞坏死诱导物处理死诱导物处理12h12h后的细胞存活率；后的细胞存活率；使用的为使用的为 CellTiter-Glo kitCel

10、lTiter-Glo kit试剂盒，试剂盒，ATPATP是活细胞新陈代谢的一个指标，是活细胞新陈代谢的一个指标，通过对通过对ATPATP定量测定可以检测培养物定量测定可以检测培养物中的活细胞数目；磷酸化的中的活细胞数目；磷酸化的MLKLMLKL与细与细胞死亡具有一定的相关性。胞死亡具有一定的相关性。图图B B 进一步验证了进一步验证了MLKLMLKL磷酸化磷酸化与细胞死亡相关；从图可以看与细胞死亡相关；从图可以看出出HT-29HT-29细胞在细胞在TSZTSZ共同处理下共同处理下不同时间的不同时间的p-MLKLp-MLKL、ATPATP水平水平和膜泄漏情况（通过测定胞质和膜泄漏情况（通过测定胞

11、质蛋白酶的活性得到，蛋白酶的活性得到，CytoTox-CytoTox-Glo kitGlo kit）；）；6 6小时后三个信号小时后三个信号同时出现变化。同时出现变化。图图C-DC-D：细胞坏死抑制剂对细胞坏死抑制剂对MLKLMLKL磷酸化的不同影响；（磷酸化的不同影响；（Nec-1Nec-1：RIP1RIP1抑制剂；抑制剂；NSANSA：MLKLMLKL抑制剂）；磷酸化的抑制剂）；磷酸化的MLKLMLKL信号可以被信号可以被Nec-1Nec-1阻止，但不能被阻止，但不能被NSANSA阻阻止，表明止，表明MLKLMLKL在细胞坏死中功能位于在细胞坏死中功能位于RIP1/RIP3RIP1/RIP

12、3的下游；的下游；图图E E：Knocking downKnocking down RIP3RIP3的表达可以阻止的表达可以阻止MLKLMLKL的磷酸化；敲除任一蛋白均的磷酸化；敲除任一蛋白均可阻止细胞坏死或减弱可阻止细胞坏死或减弱MLKLMLKL磷酸化信号（磷酸化信号（4 4、6 6道），但敲除道），但敲除MLKLMLKL不能阻止不能阻止RIP3RIP3对其的磷酸化（对其的磷酸化（2 2、6 6道）；道）； 补充图中又对另一种人类细胞系（白血病细胞株补充图中又对另一种人类细胞系（白血病细胞株U937U937）进行了类似的研究，发现）进行了类似的研究，发现MLKLMLKL磷酸化信号和磷酸化信号

13、和细胞坏死的相关性同样出现在细胞坏死的相关性同样出现在U937U937细胞系中。细胞系中。 图图2A2A：采用采用Trion X-114Trion X-114分离内在膜蛋白的示意图；分离内在膜蛋白的示意图；图图2B2B：HT-29HT-29在在TSZTSZ处理的不同时间点细胞提取物的处理的不同时间点细胞提取物的western blottingwestern blotting情况；情况；细胞坏死诱导细胞坏死诱导6 6小时后，磷酸化的小时后，磷酸化的MLKLMLKL在水相出现，且非磷酸化的在水相出现，且非磷酸化的MLKLMLKL逐渐逐渐减少；同时，磷酸化的减少；同时，磷酸化的MLKLMLKL此时出

14、现在膜相；暗示此时出现在膜相；暗示MLKLMLKL在被在被RIP3RIP3磷酸化后从磷酸化后从溶胶转移到膜部分。溶胶转移到膜部分。图图2C2C：NSANSA（MLKLMLKL抑制剂）先前验证出不能阻止抑制剂）先前验证出不能阻止MLKLMLKL发生磷酸化，但可以阻发生磷酸化，但可以阻止细胞坏死，止细胞坏死，现在验证现在验证NSANSA可以阻止可以阻止p-MLKLp-MLKL转移到膜上转移到膜上；分别对比；分别对比2 2、6 6和和4 4、8 8，在没加坏死抑制剂时，在没加坏死抑制剂时，p-MLKLp-MLKL主要集中在膜上，加抑制剂后，则主要在主要集中在膜上，加抑制剂后，则主要在水相，暗示水相，

15、暗示NSANSA虽然不影响虽然不影响MLKLMLKL的磷酸化，但的磷酸化，但p-MLKLp-MLKL不转移到膜上；不转移到膜上；图图2D2D：MLKLMLKL磷酸化位点突变后在细胞坏死过程中不会转移到膜上。磷酸化位点突变后在细胞坏死过程中不会转移到膜上。 图图3A3A：差速离心分离细胞器的基本步骤；差速离心分离细胞器的基本步骤；图图3B3B：细胞器特异性标记（质膜和核内体：细胞器特异性标记（质膜和核内体：EGFREGFR；线粒体：；线粒体：Tom20Tom20；溶酶体和；溶酶体和核内体核内体: : Lamp1Lamp1 ；内质网：；内质网：ERp72ERp72）；）；左图左图显示仅用显示仅用T

16、NFTNF处理，不出现处理，不出现p-MLKLp-MLKL，且且MLKLMLKL、RIP3RIP3、RIP1RIP1主要存在于主要存在于S100S100，即上清液水相中；，即上清液水相中；RIP1RIP1在水相和膜上都在水相和膜上都比较多，暗示其可结合比较多，暗示其可结合TNFTNF受体。受体。右图右图显示在显示在TSZTSZ处理后，处理后，p-MLKLp-MLKL出现在各种细出现在各种细胞器膜上。胞器膜上。图图3C3C： 前三行前三行红色点红色点和绿色和绿色点的重点的重叠百分叠百分比为比为14%-14%-23%23%；细胞膜细胞膜的的p-p-MLKLMLKL信信号为号为22%22%。线粒体线

17、粒体内质网的正内质网的正常驻留蛋白常驻留蛋白溶酶体和溶酶体和核内体核内体微分干涉图像微分干涉图像质膜质膜 补充图补充图 图图4A4A：P-MLKLP-MLKL在非还原凝胶中有寡聚体存在，在还原凝胶则没有；寡聚体靠二在非还原凝胶中有寡聚体存在，在还原凝胶则没有；寡聚体靠二硫键连接；硫键连接；图图4B4B：采用凝胶过滤（采用凝胶过滤（Superdex 200Superdex 200）分析纯化的重组蛋白）分析纯化的重组蛋白MLKLMLKL；洗脱位置表；洗脱位置表明了分子大小（见标尺，甲状腺球蛋白明了分子大小（见标尺，甲状腺球蛋白,670 kDa;,670 kDa;铁蛋白铁蛋白,440 kDa;BSA

18、,67 kDa;,440 kDa;BSA,67 kDa;卵清蛋白卵清蛋白,44 kDa;,44 kDa;核糖核酸酶核糖核酸酶A,14 kDaA,14 kDa）；）；非还原凝胶非还原凝胶还原凝胶还原凝胶图图4C4C：使用化学交联剂检测使用化学交联剂检测MLKLMLKL蛋白的自组装；左边不含交联剂的蛋白的自组装；左边不含交联剂的MLKLMLKL蛋白全蛋白全为单体；右边加入交联剂后蛋白出现寡聚体；但为单体；右边加入交联剂后蛋白出现寡聚体；但357A/358A357A/358A突变不能磷酸化故突变不能磷酸化故而仍为单体；而仍为单体；图图4D4D：MLKLMLKL磷酸化对于细胞坏死过程中寡聚体的形成是必

19、须的（非还原状态）；磷酸化对于细胞坏死过程中寡聚体的形成是必须的（非还原状态）；左边正常型可以发生磷酸化，因此既有单体又有寡聚体，右边突变后不能磷酸左边正常型可以发生磷酸化，因此既有单体又有寡聚体，右边突变后不能磷酸化因而只有单体形式；化因而只有单体形式； 图图5A5A：（TAGTAG：甘油三酯；：甘油三酯；DAGDAG：甘油二酯；：甘油二酯；PAPA：磷脂酸；：磷脂酸；PSPS：磷酯酰丝氨酸；：磷酯酰丝氨酸；PEPE：磷脂酰乙醇胺；：磷脂酰乙醇胺；PCPC：卵磷脂；：卵磷脂；PGPG：磷脂酰甘油；：磷脂酰甘油；Cardiolipin:Cardiolipin:心磷脂；心磷脂；PIPI：磷脂酰肌

20、醇；磷脂酰肌醇；CholesterolCholesterol：胆固醇）；：胆固醇）；1515种膜脂的布局图；种膜脂的布局图；图图5B5B：MLKL-FL(full-lengthMLKL-FL(full-length，1471 aa); MLKL-CC(coiled-coil 1471 aa); MLKL-CC(coiled-coil domain,1178 aa); MLKL-KL( kinase-like domaindomain,1178 aa); MLKL-KL( kinase-like domain，179471 aa)179471 aa)；使用；使用Anti-N-terminal o

21、r C-terminal MLKL antibodies Anti-N-terminal or C-terminal MLKL antibodies 检测检测 MLKL signalMLKL signal。4 4种种磷脂磷脂-心磷脂、心磷脂、PI4PPI4P、PI(4,5)P2PI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3PI(3,4,5)P3结合最多；结合最多；KLKL结构域不结合任结构域不结合任何脂质。何脂质。图图5C5C：MLKLMLKL结合包含磷脂的脂质体；结合包含磷脂的脂质体；S S：上清；：上清；P P：沉淀物；只有：沉淀物；只有PI(4)PPI(4)P和和PI(4,5)P2PI(4,

22、5)P2招募到了招募到了MLKLMLKL蛋白，且蛋白，且PI(4,5)P2PI(4,5)P2对对MLKLMLKL有更高的亲和力；绝大多有更高的亲和力；绝大多数的数的MLKLMLKL蛋白与包含蛋白与包含15%15%心磷脂的脂质体（与线粒体水平接近）结合，而只心磷脂的脂质体（与线粒体水平接近）结合，而只有少量蛋白与包含有少量蛋白与包含5%5%心磷脂的脂质体结合；心磷脂的脂质体结合；图图5D5D：通过比较正常型和突变型通过比较正常型和突变型MLKLMLKL蛋白对脂质体亲和力的区别，进一步验蛋白对脂质体亲和力的区别，进一步验证证MLKLMLKL对脂质体结合的特异性。对脂质体结合的特异性。图图6A-C6

23、A-C：先让先让Tb3+Tb3+离子和脂质体结合，然后和带有离子和脂质体结合，然后和带有DPADPA的的MLKLMLKL蛋白孵育，蛋白孵育，Tb3+Tb3+有弱荧光活性，当从脂质体中释放与有弱荧光活性，当从脂质体中释放与DPADPA结合时，结合时，Tb3+/DPATb3+/DPA螯合物使荧光活性螯合物使荧光活性增加增加10104 4倍，从而给出脂质体破裂的信号；倍，从而给出脂质体破裂的信号；图图6A6A为三种形式的为三种形式的MLKLMLKL蛋白膜破裂蛋白膜破裂情况；情况；图图6B6B为脂质体中包含不同脂类时膜破裂的情况；为脂质体中包含不同脂类时膜破裂的情况；图图6C6C为添加为添加NSANS

24、A后可以后可以抑制膜的破裂；抑制膜的破裂；图图6D6D：MLKLMLKL全长或全长或N N端卷曲结构域可以使膜破裂；而端卷曲结构域可以使膜破裂；而C C端激酶结构域不起作用；端激酶结构域不起作用；图图6E6E：采用人类骨肉瘤细胞系采用人类骨肉瘤细胞系U2OSU2OS，其中，其中MLKL-FKBPVMLKL-FKBPV融合蛋白受融合蛋白受doxycyclinedoxycycline（多西环素）诱导的启动子控制，（多西环素）诱导的启动子控制，U2OSU2OS不表达不表达RIP3RIP3，因此正常情况下不经历细，因此正常情况下不经历细胞坏死；仅当胞坏死；仅当DoxDox存在时可表达融合蛋白，但有存在时可表达融合蛋白，但有30%30%的细胞死亡，添加的细胞死亡，添加AP20187AP20187后，细胞死亡率增加到后，细胞死亡率增加到60%60%；添加；添加z-VADz-VAD和和Nec-1Nec-1时没有显著变化，但添加时没有显著变化，但添加NSANSA时时细胞死亡率下降，暗示细胞死亡是由细胞死亡率下降，暗示细胞死亡是由MLKLMLKL介导