口蹄疫疫苗制备工艺

1、口蹄疫疫苗制备工艺猪口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus , FMDV引起 的猪等偶蹄动物多发的一种急性、热性和传播极为迅速的接触性传染病。该病早 在14世纪的意大利学者第1次描述了 FMDV1898年，Loeffler 和Frosch等证 明了口蹄疫的病原体为滤过性病毒。 本病广泛分布于世界各地，目前除有少数国 家已经扑灭本病外，至今仍有70多个国家还时有发生。该病的发病率几乎达 100%但病程一般呈良性经过，死亡率只有2%3%,仔猪呈恶性病型，死亡率 可达50%70%，该病除导致猪死亡造成直接经济损失外， 最为严重的是由于其 传染性极强和引起大规模

2、流行，并影响一个国家的畜产品进出口贸易， 造成巨大 经济损失和政治影响，所以国际兽疫局将该病列为A类家畜传染病之首，并列入 世界范围内重要传染病研究行列。口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。其最大颗粒直径为 23纳 米，最小颗粒直径为78纳米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个主型 c A、 0、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型，以及65个以上亚型。0型口蹄疫 为全世界流行最广的一个血清型， 我国流行的口蹄疫主要为 O、A、C三型及ZB 型（云南保山型）。据观察，一个地区的经过有效的口蹄疫之后，1 2月内又会流 行，这往往怀疑是另一型或亚型所致。 这是因为该病毒易发生变异。该病毒对外

3、 界环境的抵抗力很强，在冰冻情况下，血液及粪便中的病毒可存活120 170天。 阳光直射下60分钟即可杀死；加温85 C 15分钟、煮沸3分钟即可死亡。对酸 碱之作用敏感，故1%一 2%氢氧化钠、30%热草木灰、1%一 2%甲醛等都是良 好的消毒液。1. 材料1. 1主要设备生物反应器、细胞计数仪。1. 2 BHK21细胞悬浮适应株1. 3 口蹄疫种毒OJMV2000株为现行牛口蹄疫双价疫苗制苗毒株，每 0. 2 mL 含有的LD5。为107.0，亚洲I型为Asia 1 /JSL/GSZ06株，每0. 2 mL含有的L6 为 107.514 培养基细胞培养用培养基、病毒繁殖用细胞维持培养液、犊

4、牛血清。15 其他主要化学试剂 消化液： EDTA - 胰酶 灭活剂：二乙烯亚胺 ( BEI) 阻断剂：硫代硫酸钠或焦亚硫酸钠溶液 油佐剂1. 6试验动物孚L鼠24日龄吮小鼠，临床健康。2. 方法2. 1细胞培养BHK2i细胞系是制备FMD疫苗所需病毒抗原的理想细胞系。采用 转瓶培养培养 BHK21 细胞。转瓶培养是将种子细胞用消化液分散成单个细胞后加 营养液震荡 , 使细胞分散于营养液中 , 再将此营养液按一定比例分装于若干圆 柱形细胞瓶中，给细胞瓶加塞扎口后放置于转瓶机上37°C旋转培养，使营养液 中的细胞附着于瓶壁 , 交替接触营养液而分裂增值。 传统的消化液采用 EDTA-

5、胰 酶。2.2 病毒液制备 选取培养2- 3 d 、形态良好致密的单层 BHK21 细胞接入种毒 , 37 摄氏度培养 0. 5 h- 2 h 使病毒吸附于细胞后加入维持液继续培养 , 当细胞病变 达90% ( CPE ) 以上时, 即可收取病毒液 , 病毒液经菌检及效检合格后方可进入 下一环节。实践证明病毒液反复冻融使细胞破裂 , 充分释放包含的病毒粒子 , 可 提高病毒效价。转瓶病毒培养属劳动密集型方法 , 较难控制污染且容易散毒 , 但 生产的病毒液效价比较高。 悬浮培养法增值病毒是当反应器中悬浮培养的细胞数 达到3 X 107 /mL时接毒,约20-30 h后收毒,病毒液的TCID5。

6、可达7- 8 。2.3病毒纯化 使用中空纤维超滤膜纯化浓缩FMD抗原，原液通过射流泵，在一 定的压力下呈湍流状态在中空纤维超滤膜内或外表分布流动 , 溶剂和小于截留 分子量的物质透过膜的俗称透过液 , 而大于膜截留分子量的胶质等被截留的俗 称浓缩液 , 如要返回到原液中时 , 其原液的浓度会逐渐升高 , 此过程称为“ 浓 缩” , 如此反复 , 从而实现大小分子量的分离 , 浓缩和提纯的目的。2. 4抗原灭活 甲醛曾是FMDV®苗生产中应用最为广泛的灭活剂，但经研究发 现, 病毒液中的水解孚蛋白等物质能抑制甲醛的灭活作用而导致灭活不彻底。 上 世纪 80年代以来多数疫苗生产厂家改用乙

7、烯亚胺类衍生物 ( aziridine ) 作为灭 活剂, 其中二乙烯亚胺 ( BEI) 因毒性较小 , 现在被广泛使用。 2000 年世界动物 卫生组织（OIE ）向各国推荐使用1 mmo l/L BEI两次灭活法,即20-37 C灭活24 h后再加一次BEI灭活24 h,经多年应用效果较好。2006年OIE又推荐了 3 mmol /L BE I两次灭活法,BEI用量增加到3 mmo l/L, 26 C分两次共灭活48 h,灭活 剂用量加大使疫苗安全性更高 , 温度降低有利于保持病毒粒子 146S 完整性。研 究表明乙烯亚胺类衍生物与甲醛相比 , 不仅毒性大而且灭活后病毒稳定性差 , 甲醛灭

8、活的弗氏佐剂疫苗有效期可达10年，而BEI灭活的同类疫苗有效期仅2年 左右。另有研究表明SAT型FMDV经乙烯亚胺类衍生物灭活后再经甲醛处理,稳 定性明显提高。甲醛与BE I协同作用可将灭活效力提高100咅并且缩短了灭活时 间, 既改善了疫苗的安全性又保护了抗原完整性 , 因此这种方法值得在生产中 推广。灭活终止后应立即在抗原中加入阻断剂中和多余的乙烯亚胺类衍生物 , 常 用的阻断剂为硫代硫酸钠或焦亚硫酸钠溶液。2.5乳化早期的FM疫苗都采用氢氧化铝作为佐剂，人们发现氢氧化铝佐剂疫 苗的不足之处在于：对牛效果较好，而对猪效果差。只能增强TH1型免疫反应， 而不能增强细胞介导免疫（CMI）。注射

9、局部有红斑、肿胀和硬结。现在多使用的 油佐剂疫苗对猪、牛都具有免疫效力，主要诱导产生Th2型反应。油佐剂在使用 时一般预先将乳化剂 （如山梨醇苷单油酸脂 ） 和液状石蜡混合 , 加入水相抗原 , 经乳化制成油包水型乳剂 , 再加入含聚山梨脂的水相抗原进行乳化 , 制成较复 杂的双相 （水包油包水型 ）乳剂疫苗。实验证明双相油佐剂疫苗黏稠度低 , 效果较 好而且能够用于所有的动物。 油佐剂的主要缺点是副作用较强 , 特别是皮下注射 有时会在注射部位引起炎症甚至溃疡和肉芽肿。2.6 安全性检验 灭活完成后 , 每批灭活抗原样品应通过敏感单层细胞传代或乳 鼠接种试验 , 以判定灭活抗原的安全性。 敏感单层细胞传代时通常传 2- 3代应无 细胞病变 （ CFU） 。样品接种乳鼠后连续观察 7日应全部健康。欧洲药典规定 , 牛 FMD灭活疫苗制苗病毒液