单羟基四苯基卟啉的合成及与BSA的作用new

1、单羟基四苯基卟啉单羟基四苯基卟啉及及配合物的合成及配合物的合成及与与BSA的作用实验意义及原理卟啉化合物与生命科学密切相关，在生物体的多种生理机能中起着非常重要的 作用。许多生命现象都有卟啉及其配合物的参与，生物体所含的卟啉化合物主要包括血红素、叶绿素、维生素B 12,节肢动物血液中含铜的卟啉化合物、以及海鞘类 动物血液中能与钒原子结合的双吡咯基团（相当于半个卟啉环等，所以卟啉及其配合 物的合成、结构和性质研究受到人们的重视。所有这些应用的深入研究，均要求卟啉化合物具有活性基团。因此，带有活性基团的卟啉化合物的合成及其生物活性研 究,成为卟啉化合物研究的热点1-2,这其中包含系列羟基苯基卟啉化

2、合物。1. 卟啉及配合物合成路线：refluxpropionic acidCHOCHO2. 卟啉有强的紫外吸收，吸收光谱包括两个不同的区域，在390425nm之间有一 个强烈的吸收带（具体出现位置要取决于卟啉环是 B位取代还是中位取代，这一吸收 带称为B带或Soret带。另外有两个或者4个较弱的吸收带出现在480700nm称 为Q带，当卟啉与金N N H NHNOH N N N N OH M(A c2CHCI 3M M =N i,Co,Z n ,Cu属形成配合物后,Q带的吸收峰由4个减至2个。这些带的数目和强度能够有 力地证明卟啉环的取代方式以及它是否含有中心金属，同时带的数目也是对卟啉的 光

3、谱进行分类的依据。卟啉和 BSA相互作用过程中，会导致卟啉Soret带最大吸收 发生改变。3. 卟啉化合物对牛血清白蛋白(BSA的荧光猝灭效应BSA的内源荧光来自分子中色氨酸和酪氨酸残基，卟啉化合物的加入能使其荧 光规律性猝灭。荧光猝灭过程通常由动态猝灭和静态猝灭之分。动态猝灭是猝灭剂与荧光激发态分子之间的相互作用过程。遵从Stern-Volmer方程3:F0/F=1+K svQ=1+k q t 0Q(1静态猝灭是卟啉分子(猝灭剂与BSA(荧光体分子在基态时形成不发光的配合物 或分子间复合物，从而导致荧光体发光强度的降低。可适用于改进的 Stern-Volmer 方程4-5:1/(F-F0=1

4、/F0(1+K D/Q(2(F和F0分别为猝灭剂浓度等于Q和无猝灭剂时荧光体的相对荧光强度,K sv 为动态猝灭常数,k q为双分子猝灭过程速率常数，T0无猝灭剂时荧光分子的平均寿命,对于生物大分,t O=10s,K D为复合物的解离平衡常数。K A为复合物的形成 稳定常数,K A=1/K D。各种猝灭剂对生物分子的最大扩散碰撞猝灭常数2.0 >1010（mol/L-1.s-1,如果大大超出此数值，一般可以认为是静态猝灭。二、实验目的1. 熟悉卟啉及其配合物的合成和性质；2. 学习卟啉与生物大分子相互作用的原理；3. 学习用紫外/荧光实验研究有机分子与生物大分子相互作用的实验技术和数 据

5、处理。三、试剂与仪器1.试剂：新蒸吡咯（M=67.09,4-羟基苯甲醛（M=122.12,苯甲醛（M=106.13,丙酸（b.p=137 141 T ,乙醇，甲醇，硅胶（100-200目牛血清白蛋白（BSAQMF,二次水。2仪器：UV-1601紫外/可见光谱仪（日本岛津公司；Schimadzu RF-5301荧光光谱 仪,Varian-Mercury300超导核磁共振仪，Shiadzu FTIP-8100红外光谱仪。四、实验步骤1.5- （4-羟基苯基-10,15,20-三苯基卟啉的合成6250mL三颈烧瓶装上恒压滴液漏斗、回流冷凝管，瓶中加入100mL丙酸,加热控 制油浴温度为140C左右,

6、使丙酸微沸。依次加入对羟基苯甲醛 1.17g（9.57mmol,苯 甲醛2.67mL(26.3mmol,搅拌使之溶解。然后通过恒压滴液漏斗滴加新蒸馏的吡咯 2.43mL(35mmol, 5min内滴加完毕。继续加热，在丙酸微沸的条件下搅拌回流 30- 45min。停止加热，冷却至3035°C后减压蒸馏出丙酸70mL,冷却到80C左右时加入 80mL无水乙醇,析出紫色固体，抽滤，用乙醇洗涤紫色固体，干燥，得到紫色固体卟啉混 合物。2.5- (4-羟基苯基-10,15,20-三苯基卟啉的分离纯化将得到的混合物，在硅胶柱上层析分离，用氯仿淋洗，收集第一带，经薄层色谱分析 鉴定为四苯基卟啉。

7、然后用氯仿/甲醇(体积比为100:1做淋洗剂收集第二带。蒸发 浓缩后用氯仿和甲醇重结晶，得到紫色晶体。即为产物5-(4-羟基苯基-10,15,20-三苯 基卟啉(C44H30N4O,M=630.24,产率 5%,m.p.> 300C。注意:氯仿回收重复使用、用薄层色谱监测分离效果及产物。3.5- (4-羟基苯基-10,15,20-三苯基卟啉配合物的合成50mL烧瓶装上回流冷凝管，瓶中加入20mL CHCI3,20mg5-(4-羟基苯基-10,15,20-三苯基卟啉,20mg醋酸锌,加热回流30-45min。用薄层色谱监测反应进程， 直到原料消失。蒸干溶剂，将得到的混合物用少量氯仿溶解，在

8、硅胶柱上层析分离，用 氯仿淋洗，用薄层色谱鉴测，收集第二带。蒸发浓缩后用氯仿和甲醇重结晶，得到紫色 晶体。即为产物Zn-5-(4-羟基苯基-10,15,20-三苯基卟啉，m.p.> 300C。其它卟啉配 合物的合成方法相同。4.5- (4-羟基苯基-10,15,20-三苯基卟啉及配合物的结构表征用红外、核磁共振氢谱、紫外和质谱进行结构表征。5.卟啉及卟啉配合物(下称卟啉和BSA相互作用的荧光光谱和紫外/可见光谱检 测及数据处理A. 卟啉和BSA相互作用的荧光光谱及数据处理BSA的内源荧光来自分子中色氨酸和酪氨酸残基。荧光光谱测定中，激发波长 入ex= 290nmg过调节荧光仪激发和发射狭

9、缝的大小，使对照组的荧光强度在290- 500nm之间。卟啉化合物的加入能使 BSA的内源荧光产生规律性猝灭。配制BSA(平均分子量 M=65000的水溶液(2 >10-6mol/L10mL,卟啉化合物的 DMF 溶液(4 X0-4mol/L10mL 0采用滴定法，在室温(25C下测定荧光光谱。操作如下： 取平口的10或20L微量进样器一支； 将荧光池中装3mL BSA溶液，测定其在290-500nm的荧光光谱； 每次加入卟啉溶液(搅拌1分钟,使之混合均匀，并测定其在290-500nm的 卄、/,荧光光谱;共计加入10次卟啉溶液，得到不同浓度卟啉作用下,荧光光谱的变化;(BSA与卟啉的浓

10、度比依次为 1:021:0.4,1:0.6,1:0.8,1:1.0,1:1.2,1:1.4,1:1.6,1:1.8,1:2.0 在Origin中作F0/F-浓度Q曲线,找出每条曲线荧光强度的最大值 F0或F,用F0/F=1+K svQ=1+k q t 0Q作动态猝灭处理 根据F0/F-浓度Q曲线，求出k q,当k q>2.0采010(mol/L-1.s-1时，按静态猝灭方程：1/(F-F0=1/F0(1+K D/Q处理作1/(F-F0-C曲线，求出K A和K D。B. 卟啉和BSA相互作用的紫外/可见光谱检测及数据处理配制BSA（平均分子量 M=65000的水溶液（2 >10-4m

11、ol/L10mL,卟啉化合物的 DMF 溶液（4 X0-6mol/L10mL 0采用滴定法，在室温（25C下测定紫外/可见光谱。操作如下： 取平口的10或20卩匚微量进样器一支； 将比色皿中装3mL卟啉溶液，测定其在390-700nm的紫外/可见光谱； 每次加入3卩L BSA溶液（搅拌1分钟,使之混合均匀，并测定其在200-700nm 的紫外/可见光谱;共计加入10次BSA溶液,得到不同浓度BSA作用下，卟啉的紫外/ 可见光谱的变化；（卟啉与BSA的浓度比依次为1:0.2,1:0.4,1:0.6,1:0.8,1:1.0,1:12 1:141:1.6,1:1.8,1:2.0 在Origin中作A

12、-浓度Q曲线:以每条紫外吸收（约420nm曲线的最大值A为 纵坐标，浓度Q为横坐标，作A-浓度Q曲线。观察紫外吸收是否有红移？用线性拟合观 察卟啉和BSA相互作用后的紫外吸收变化的规律性。-BSA -体系（卟啉C. 紫外差谱:体系（卟啉-BSA将卟啉与BSA1:1结合体系的紫外/可见光谱，及相同浓度的卟啉的紫外/可见光 谱，将两者相减,即得紫外差谱。将紫外差谱与相同浓度的 BSA紫外/可见光谱比较， 进一步确定荧光猝灭机制。注意事项：a在制取卟啉的过程中，丙酸必须保持微沸。温度过高会加快吡咯的聚合，使产率降低反应停止后，必须让反应溶液温度降低到3040C左右,才能减压蒸馏，否则容易 导致爆沸，

13、影响蒸馏进程。b配制BSA水溶液时，要使BSA充分溶解。c卟啉和BSA要充分混合,使反应完全。d在进行光谱测定时，比色管、比色皿要洗涤干净，测定前先用二次水洗涤，再用 少量被测溶液洗涤。由低浓度到高浓度依次测定。参考文献：1 石伟民，陶京朝，吴健。卟啉及其衍生物合成进展J。化学通报,2005(10:751- 759.2 李向清，徐跃,石莹岩等。系列羟基苯基卟啉单体的合成与表征J。自然科学进展,2002,12(2:201-204.3 陈国珍，黄贤智，许金钩等。荧光分析法(第二版，北京:科学出版社，1990。4 Klotz I.M.,H unston D. L.Protein In terractio n with small moleculars.Relati on betwee n stoicchiometricbin di ng con sta ntsJ .J .Biol.Chem.,1975,250(8:30013009.5 Masami T.,Yutaka A.,Seizo M.etc.,Chem.Pharm.Bull.,1998,46