人酪氨酸酶相关蛋白┐2的cDNA克隆及表达

1、ÈËÀÒ°±ËáøÏà¹Øµ°°×©´2µÄcDNA¿Ë¡¼°±í´ï×÷ÕߣºÍõÇï·ã¡¡¸ßÌ&

2、#236;ÎÄ¡¡Àî´ºÓ¢¡¡ÉòÖù¡¡ÀîÇ¿ ¡¾¹Ø¼ü´Ê¡¿¿Ë¡ ¹Ø¼ü´Ê:ÀÒ°±Ëá

3、5;¸Ïà¹Øµ°°×-2;¿Ë¡Èںϱí´ï°×ñ°·ç ÕªÒª:Ä¿µÄ¿Ë¡ÀÒ°±ËáøÏà

4、;¹Øµ°°×-2£¨TRP-2£©±àÂë»ùÒò£¬±í´ïTRP-2µ°°×.·½·¨´ÓÅàÑøµÄÈ˺ÚËØÏ

5、4;°ûÖÐÌáÈ¡×ÜRNA£¬·´×ªÂ¼³ÉcDNA£¬Í¨¹ýPCR·½·¨À©ÔöTRP-2±àÂë»ùÒò£¬¿ËÂ&

6、#161;ÖÁpUC19ÔØÌå²¢²âÐò£¬ÔÙÑÇ¿Ë¡ÖÁ¹Èë׸ÊëÄÛÏ»ùתÒÆø£¨GST£©ÈÚ

7、;ºÏ±í´ïÔØÌåpGEX-4T-1£¬×ª»¯´ó³¦¸Ë¾ú£¬IPTGÓÕµ¼±í´ïTRP-2/GSTÈںϵ°°×.½á¹û

8、´ÓÅàÑøµÄÈ˺ÚËØϸ°ûÖÐÀ©Ôö³ö±àÂëTRP-2µÄcDNA£¬ÐòÁвⶨ֤ʵÓë

9、06;ÄÏ×±¨µÀµÄÐòÁÐÒ»Ö³ɹ¦¹¹½¨ÁËGSTÈںϱí´ïÔØÌåpGEX-4T-1/TRP-2;±í´ïÁËTRP-2/GS

10、TÈںϵ°°×.½áÂ۳ɹ¦¿Ë¡ÁËÈËTRP-2»ùÒò£¬¹¹½¨ÁËGSTÈںϱí´ïÔØÌå&#

11、178;¢±í´ïÁËTRP-2/GSTÈںϵ°°×. ¡¡¡¡Keywords:tyrosinaserelatedprotein-2;clone;fusionex-pression;vitiligo ¡¡¡¡Abstract:AIMToclonethecDNAofhumantyrosinasere-latedprotein2£¨TRP-2&#

12、163;©andexpressthecorrespondingpro©´tein.METHODSTotalRNAwasisolatedfromculturedhu-manpigmentalcellsandmRNAwasreverslytranscribedinto¡¡cDNA.ThenPCRwasusedtoamplifytheTRP-2codingre-gion.ThePCRproductwasclonedintopUC19plasmidandsequenced£¬thensubclonedintovectorpGEX-4

13、T-1.TheTRP-2proteinwasexpressedinE.coliofDH5¦ÁasfusionproteinwithglutathioneS-transferase£¨GST£©inducedbyIPTG.RESULTSTRP-2codingregionwasclonedintopUC19andthesequencewasconfirmed;FusionexpressingvectorofpGEX-4T-1/TRP-2wassuccessfullyconstructed;TRP-2/GSTfusionproteinwas

14、correctlyexpressed.CON©´CLUSIONHumanTRP-2geneissuccessfullyclonedandTRP-2/GSTfusionexpressingvectorisconstructed.TRP-2/GSTfusionproteiniscorrectlyexpressedinE.coli. 2 / 12 ¡¡¡¡0ÒýÑÔ ¡¡¡¡ÀÒ°±ËáÃ&#

15、184;Ïà¹Øµ°°×-2£¨tyrosinaserelatedpro-tein-2£¬TRP-2£©DHI-2ôÈËáת»¯¹ý³ÌÖз¢»Ó×÷ÓÃ.TRP-2ÊÇÒ»ÖÖ

16、;°ûÖÊ¿¹Ô­Óë°×ñ°·çµÄ²¡Àí»úÖÆÓйأ¬ÔÚ°×ñ°·ç¡¢¶ñÐÔºÚËØ

17、;Áö¼°½ÓÊÜÌØÒìÐÔÃâÒßÖÎÁƶø²úÉúÉ«ËؼõÍ˵Ļ¼ÕßѪÇåÖп¹

18、;TRP-2IgGµÎ¶È½Ï¸ß.´ËÍ⣬¿¹TRP-2×ÔÉí¿¹ÌåÓëTRP-2»òÀÒ°±Ëáø¾ù¿É·¢Éú·´

19、1;¦£¬¼´TRP-2ÓëÀÒ°±ËáøΪ½»²æ¿¹Ô­.Òò´Ë£¬¿Ë¡²¢·­ÒëTRP-2µÄcDNAÐòÁÐ&

20、#163;¬¿ÉΪ½øÒ»²½Ì½Ë÷ÀÒ°±ËáøÓëTRP-2µÄ½»²æ¿¹Ô­±íλ¼°°×ñ°·çµ&#

21、196;·¢²¡»úÖƺÍÖÎÁÆ´òÏ»ù´¡. ¡¡¡¡1²ÄÁϺͷ½·¨ ¡¡¡¡1.1²ÄÁÏÈ˺Ú&

22、#203;Øϸ°ûϵ¡¢¿Ë¡ÖÊÁ£pUC19¡¢±í´ïÖÊÁ£pGEX-4T-1ºÍ¾úÖêDH5¦ÁÓɵÚËľüÒ½´&#

23、243;ѧÎ÷¾©Ò½ÔºÆ¤·ô¿ÆʵÑéÊÒ±£´æ×ÜRNAÌáÈ¡ÊÔ¼ÁºÐ¹ºÓÚ»ªÃÀ¹«Ë

24、;¾BamHI£¬EcoRI£¬T4DNAÁ¬½Óø¹ºÓÚTaKaRa¹«Ë¾TaqDNA¾ÛºÏø£¬·´×ªÂ¼ÊÔ¼ÁºÐ¡¢½º»Ø&#

25、202;ÕÊÔ¼ÁºÐ¹ºÓÚPromega¹«Ë¾¹Èë׸ÊëÄÛÏ»ùתÒÆø£¨GST£©´¿»¯ÊÔ¼ÁºÐ

26、5;ºÓÚCloneTech¹«Ë¾. ¡¡¡¡1.2·½·¨¸ù¾ÝÔØÌå¶à¿Ë¡øÇÐλµã¼°TRP-2µÄÐòÁУ

27、72;Éè¼ÆÒýÎï.ÆäÖÐÒýÎï5¡¯¶ËÖÐÒýÈëBamHIøÇÐλµã£¬3¡¯¶ËÒýÈëEcoRIøÇ&#

28、208;λµã.ÒýÎïÓɱ±¾©SBS¹«Ë¾ºÏ³É£¬ÒýÎïµÄÐòÁÐΪ£¨Ï»®ÏßΪø

29、9;Ðλµã£©:p15¡¯CG-GGATCC-ATGGGCTATAATTGTGGAGACTGCA3¡¯p25¡¯CG-GAATTC-GGCAAAGTTCCAGTAGGGCAAA3¡¯ ¡¡¡¡°´ÊÔ¼ÁºÐ˵Ã÷Êé·½·¨

30、;²Ù×÷£¬´ÓÅàÑøµÄÈ˺ÚËØϸ°ûÖÐÌáÈ¡×ÜRNA£¬½«mRNA·´×ªÂ¼ºÏ³ÉcDNA.Ä¿

31、;µÄ»ùÒòƬ¶Î³£¹æPCRÀ©Ôö£¬·´Ó¦Ìõ¼þΪ:95¡æÔ¤±äÐÔ2minºó¼ÓÈëTaqDNA¾Ûº&

32、#207;ø1U£¬°´94¡æ30s£¬55¡æ30s£¬72¡æ40s£¬½øÐÐ35¸öÑ­»·£¬×îºóÔÚ72¡æÑÓÉì10min.ÒÔHPV&

33、#214;Ø×éÖÊÁ£Îª·´Ó¦ÌåϵµÄÑôÐÔ¶ÔÕÕ£¬ÈýÕôˮΪ¿Õ°×¶ÔÕÕ£¬ÒÔT

34、RP-1ÖØ×éÖÊÁ£ÎªÒõÐÔ¶ÔÕÕ.PCR²úÎï½øÐÐ12g・L-1ÇíÖ¬ÌǵçÓ¾£¬¼ì²âÀ©Ô

35、6;²úÎïƬ¶ÎµÄ´óС.²úÎï¾­»ØÊÕºó£¬ÒÔBamHI£¬EcoRI˫øÇУ¬»ØÊÕÄ¿µÄ

36、;Ƭ¶Îºó¶¨Ïò²åÈ뾭ͬÑù˫øÇеÄpUC19ÔØÌåÖУ¬ÒÔT4DNAÁ¬½ÓøÁ¬½Ó.

37、ÖØ×éºóµÄÖÊÁ£×ª»¯¸ÐÊÜ̬´ó³¦¸Ë¾úDH5¦Á£¬ÌáÈ¡ÖÊÁ£ºóÒÔBamHI£¬EcoR

38、I˫øÇУ¬12g・L-1ÇíÖ¬ÌǵçÓ¾¼ø¶¨.ÖØ×éÖÊÁ£ÓÉÉϺ£Éú¹¤ÉúÎ﹤

39、9;̹«Ë¾Íê³É²âÐò.Ä¿µÄ»ùÒòƬ¶ÎµÄÑÇ¿Ë¡:½«²âÐòºóµÄÖØ×éÔØ&#

40、204;åÒÔBamHI£¬EcoRI˫øÇУ¬ÇÐϵÄƬ¶Î²åÈ뾭ͬÑù˫øÇеÄpGEX4T-1ÔØÌåÖ&#

41、208;£¬×ª»¯¸ÐÊÜ̬ϸ°ûDH5¦Á.TRP-2ÓëGSTÈںϵ°°×µÄÓÕµ¼±í´ï:¼ÓÈëÖÕŨ¶&

42、#200;Ϊ0.4mmol・L-1µÄIPTG£¬ÓÚ37¡æ·Ö±ðÓÕµ¼ÅàÑø2£¬3ºÍ4h£¬°´³£¹æ·½·¨ÊÕ¾ú£¬

43、;½øÐÐSDS-PAGE.Óñ¡²ãɨÃèÒÇ·ÖÎö¸Ãµ°°×Õ¼¾úÌå×ܵ°°×µÄº¬Á¿£Û1£Ý.

44、±í´ïµ°°×µÄ¿ÉÈÜÐÔ¼ø¶¨:ÒÔ³¬Éù²¨ÆÆËéϸ°û£¬ÊÕ¼¯±í´ï¾úÌå

45、;ºó£¬·Ö±ðÈ¡ÏàͬŨ¶ÈµÄ50¦ÌLÉÏÇå¼°³Áµí£¬½øÐÐSDS-PAGE£¬¹Û²ì±í´ï

46、Ìõ´øÊÇÔÚÉÏÇåÖл¹ÊÇÔÚ°üº­ÌåÖÐ.±í´ïµ°°×µÄ´¿»¯ÓÃClotech¹«Ë¾

47、1;ÄGSTÈںϵ°°×´¿»¯Öù£¬°´²Ù×÷˵Ã÷²Ù×÷. ¡¡¡¡2½á¹û ¡¡¡¡2.1TRP©´2»ù&#

48、210;òµÄ¿Ë¡¼°²âÐò12g・L-1ÇíÖ¬ÌÇÄý½ºµçÓ¾ÏÔʾ£¬À©Ôö³ö1ÌõºËËáÆ&

49、#172;¶Î£¬ÓëÔ¤¼ÆµÄ´óС£¨457bp£©»ù±¾Ò»Ö£¨Fig1£©.TRP-2»ùÒòµÄÀ©ÔöƬ¶Î

50、0;¿»¯ºóÓëpUC19ÔØÌåÁ¬½Ó£¬¾­BamHIºÍEcoRI˫øÇмø¶¨£¬ÇíÖ¬ÌÇÄý½ºµçÓ¾&

51、#207;ÔʾÇгö´óСԼ447bpµÄÖØ×éƬ¶Î£¨Fig2£©£¬±íÃ÷ϵÑôÐÔ¿Ë¡.²âÐò

52、89;á¹ûÓëÒÑÖªÐòÁÐÍêÈ«Ò»ÖÂ. ¡¡¡¡2.2TRP©´2/GSTÈںϱí´ïÔØÌåµÄ¹¹½¨GSTÈÚ

53、;ºÏ±í´ïÔØÌåµÄ¹¹½¨Í¨¹ýÕ³¶ËµÄÑÇ¿Ë¡½øÐУÛ2£Ý£¬¿Ë¡ÖÊÁ

54、3;pUC19/TRP-2¾­BamHIºÍEcoRI˫øÇкó£¬ÊÍ·Å447bpƬ¶Î£¬½«´ËƬ¶ÎÓëBamHIºÍEcoRI˫øÇÐÏ

55、3;ÐÔ»¯µÄÔ­ºË±í´ïÔØÌåpGEX-4T-1Á¬½Ó.ת»¯´ó³¦¸Ë¾úDH5¦Á£¬ÌáÈ¡ÖÊÁ££

56、72;¹¹½¨µÄÖØ×éÖÊÁ£¾­BamHIºÍEcoRI˫øÇУ¬ÊÍ·Å447bpƬ¶Î£¨Fig3£©£¬GSTÈںϱí

57、;´ïÔØÌåµÄpGEX-4T-1/TRP-2¹¹½¨³É¹¦. ¡¡¡¡Í¼1£­Í¼4ÂÔ ¡¡¡¡pGEX-4T-1/TRP-2/DH5¦ÁÔÚ37¡æÕñµ´Å

58、àÑøÖÁA600ֵΪ0.4£¬·Ö±ðÓÕµ¼2£¬3ºÍ4h.¾­SDS-PAGE£¬±È½ÏÓÕµ¼Ç°ºóµ°°×±í´

59、9;Çé¿ö£¬·¢ÏÖMrΪ43000µÄµ°°×ÔÚÓÕµ¼2hºó¼´ÓÐÏ൱Á¿µÄ±í´ï£¬ÓÕµ¼4

60、hºó±í´ïÁ¿Ç÷ÓÚÎȶ¨£¬ÓÕµ¼Ê±¼äµÄÔö¼Ó½öÒýÆðϸ¾úŨ¶ÈµÄ»º

61、;ÂýÔö¼Ó.ÓÕµ¼ÅàÑøºóµÄ¹¤³Ì¾úÒÔ³¬ÉùÆÆËé·¨Áѽ⣬±í´ïµÄÈ

62、8;ºÏµ°°×ÒÔ¿ÉÈÜÐÔµÄÐÎʽ´æÔÚÓڴ󳦸˾úÖУ¬¾úÌåÁѽâÒº¾

63、3;¹È°±õ£°·Ê÷Ö¬´¿»¯ÊÔ¼ÁºÐ´¿»¯£Û3£Ý£¬100g・L-1SDS-PAGEÏÔʾÒѵõ½½Ï¸

64、ß´¿¶ÈµÄµ°°×ÖÊ£¨Fig5£©. ¡¡¡¡3ÌÖÂÛ ¡¡ ¡¡¡¡°×ñ°·ç»¼ÕßѪÇåÖд

65、30;ÔÚ¿¹ºÚËØϸ°û¿¹ÌåµÎ¶ÈÓ벡Çé»î¶¯ÐÔÏà¹Ø£Û4£Ý.ÁíÍ⣬°×ñ&

66、#176;·ç»¼ÕßµÄѪÇåÔÚÌåÍâͨ¹ý¿¹Ìå½éµ¼µÄϸ°û¶¾×÷ÓÿÉÒÔɱÉ&

67、#203;È˺ÚËØϸ°û£Û5£Ý£¬±íÃ÷¿¹ºÚËØϸ°û¿¹Ìå¿ÉÄܲÎÓëÁË°×ñ°·

68、çµÄ·¢²¡.ÀûÓð×ñ°·ç»¼ÕßѪÇåÖеÄ×ÔÉí¿¹Ì壬ʹ¼¸ÖÖ°×ñ°·

69、;çÏà¹ØµÄºÚËØϸ°û¿¹Ô­ÒѵÃÒÔÃ÷È·£¬ÆäÖÐ3ÖÖ°ûÖÊ¿¹Ô­ÀÒ°±

70、3;áø¡¢ÀÒ°±ËáøÏà¹Øµ°°×-1£¨TRP-1£©£Û6£Ý¡¢ÀÒ°±ËáøÏà¹Øµ°°×-2£

71、¨TRP-2£©±íÏÖΪ40%µÄͬԴÐÔ£¬¹¹³ÉÁËÀÒ°±ËáøÏà¹Øµ°°×¼Ò×å.TRP-2»ù

72、0;òÊÇÒ»ÖÖ°ûÖÊ¿¹Ô­. ¡¡¡¡¿¹TRP-2×ÔÉí¿¹ÌåÓëTRP-2»òÀÒ°±Ëáø¾ù¿É·¢

73、1;ú·´Ó¦£¬¼´TRP-2ÓëÀÒ°±Ëáø´æÔÚ½»²æ¿¹Ô­. ¡¡¡¡Í¼5ÂÔ ¡¡¡¡ÎÒÃÇÑ&

74、#208;¾¿Ñ¡È¡±àÂëTRP-2µÄÒ»¶Î438bpµÄ»ùÒòÐòÁУ¨721¡«1158bp£©-¸ÃÐòÁÐÓëÀÒ°±Ëá

75、;ø»ùÒòÓÐ80%ͬԴÐÔ£¬ÒÑÖªµÄÀÒ°±Ëáø¿¹Ô­±í루°±»ùËá289¡«294&#

76、186;Í295¡«300£©±àÂëÇøÔÚ±¾ÐòÁÐÖÐÆä±àÂëµÄµ°°×ÓÉ146¸ö°±»ùËá×é³É£

77、;¬M rԼΪ16990.ÎÒÃÇ´ÓÅàÑøµÄÈ˺ÚËØϸ°ûÖÐÌáÈ¡×ÜRNA½øÐÐRT-PCR¼°ÌØÒìÀ©

78、;Ôö£¬»ñµÃÁËÈËTRP-2»ùÒòµÄÒ»¶Î±àÂëÇøÐòÁУ¬¾­ÐòÁзÖÎö֤ʵ£

79、¬ÓëGeneBank±¨µÀµÄÈËTRP-2»ùÒòÖÐÏàÓ¦ÇøÓòÍêÈ«Ò»Ö£Û7£¬8£Ý.ΪʹÈÚºÏ&#

80、187;ùÒòµÃµ½¸ßЧ¼°Îȶ¨µÄ±í´ïºÍ¿¼Âǵ½ÓÃÔ­ºËϸ°û±í´ïÕæºË&#

81、181;°°×µÄÌØÐÔ£¬ÎÒÃǹ¹½¨ÁËGSTÈںϱí´ïÔØÌåpGEX-4T-1/TRP-2.¸ù¾Ý±í´ïÔØÌåµ&

82、#196;ÌØÐÔ£¬ÓÃIPTGÈ¥³ýlacµÄ×è¶ô×÷Óã¬Ê¹TRP-2Ôڴ󳦸˾úDH5¦ÁÖлñµÃÁË

83、4;ßЧ±í´ï£¬Îª½øÒ»²½Ñо¿TRP-2µÄ¿¹Ô­±íλ¡¢°×ñ°·çµÄ·¢²¡»úÖƺÍÖÎÁƵ춨ÁËʵÑé»ù´¡. ¡¡¡¡²Î¿¼ÎÄÏ×: ¡¡¡¡£Û1£ÝWuYM£¬ZhangJJ£¬Ji