雌激素脂肪酯及其酯解酶与妊娠期糖尿病相关性的研究

1、雌激素脂肪酯及其酯解酶与妊娠期糖尿病 相关性的研究The correlation between estradiol fatty acid estersand its esterase with gestational diabetes研究生： 至重筮导一级学科：鳖鏖匡堂论文课题起止时间：2Q!Q生Z旦=2 Q!生鱼旦论文完成时间：至Q 1 2生三月中国医科大学(辽宁)2 01 2年3月删中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也

2、不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：兰!翌速日期： M2，、f旷中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学

3、 校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文论文作者签名：乏勉一指导教师签名：盔毖日目录一、摘要中文论著摘要 1 英文论著摘要 4 二、英文缩略语 7三、论文前言翮I舌 ·” ··”芍·”8 材料与方法 9 结果 ····”· ··17 讨论 “···· 20 结论 ·“·”一·24四、本研究创新性的自我评价 25 五、参考文献 26 六、附录 30 综述”·3

4、0 在学期间科研成绩·一40致谢 ···”··”41 个人简介 42·中文论著摘要·雌激素脂肪酸酯及其酯解酶与妊娠期糖尿病 相关性的研究目的1、比较GDM孕妇及正常孕妇血清雌激素脂肪酯(Estradiol fatty acid esters， E2FAE)及游离雌二醇(Estradiol，E2)的差异，分析E2-FAE及E2与糖、脂代谢 指标的相关性，探讨GDM的可能机理。2、检测GDM孕妇及正常孕妇皮下脂肪组织中的激素敏感性脂肪酶(Hormonesensitive lipase，HSL)水平的变化，探讨HSL与糖

5、、脂代谢的联系。方法1、研究对象选择中国医科大学附属盛京医院住院并分娩的孕晚期单胎足月孕妇31例为 研究对象(孕前体质指数(BMI)=185，239 kgm2)。其中GDM孕妇14例(GDM 组)：孕妇年龄(3329_+589)岁，孕周(3830-*063)周，孕前体重指数(2112_+210)kgm2，孕期体重增加(1982+401)kg。正常无任何合并症与并发症孕妇17例(正 常对照组)：孕妇年龄(2988±372)岁，孕周(3879_+073)周，孕前体重指数(1983-+217)kgm2，孕期体重增加(1900+497)kg。2、收集标本各组孕妇入院后空腹踮12小时，于次晨抽

6、取肘静脉血5ml，提取血清，一80低温冰箱保存，待测定血清糖脂代谢指标、E2FAE、E2。皮下脂肪标本于剖宫 产手术中采集，立即放入液氮罐并转运到一80低温冰箱保存备用，待测定HSL 蛋白表达。该研究得到中国医科大学伦理委员会批准同意，每位参加研究的孕妇 均签订知情同意书。由于收集皮下脂肪组织有一定限制，GDM组收集皮下脂肪组织8例，正常组收集皮下脂肪组织9例。3、测定指标及方法(1)孕妇年龄、分娩孕周、收缩压(Systolic blood pressure，SBP)、舒张压 (Di舔tolic Mood pressure)、孕前体重、身高等基本信息从住院病历及询问病史中 获得，空腹血糖(Fa

7、sting blood glucose，FBG)、血清总胆固醇(Total cholesterol， TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein， LDL)、高密度脂蛋白(nigh density lipoprotein HDL)，载脂蛋白A-I(Apo A-I)， 载脂蛋白B(ApoB)等指标查阅化验结果获得。(2)改良铜试剂比色法测定血清游离脂肪酸(Free fat acid，n狐)水平。酶 联免疫法测定血清空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)水平。采用HOMA稳态模型计算HOMA-IR，HOMA-m=

8、FBG×FS225，HOMA-IR数值越大表明胰岛素抵抗程度越重； (3)采用时间分辨荧光免疫分析测定两组孕妇血清E2FAE和游离E2浓度。比较两组孕妇血清E2FAE和游离E2水平的变化，并分析其与糖、脂代谢指标之 间的关系；(4)Western blot半定量法测量两组孕妇皮下脂肪组织HSL的蛋白水平表达，并分析其与血清糖、脂代谢指标之间的关系。4、统计方法采用SPSSl70统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差(工±s)表示，两 组间比较采用t检验，相关分析采用直线相关分析。以P<005为差异有统计学意 义。结果1、GDM组FINS、HOMA-IR及F

9、FA明显高于正常对照组(P-003，P-0049， P=0oo)。患者年龄、孕周、孕前体重增长、DBP、SBP、TG、TC、LDL、HDL、 FBG、舢地“I、AimB水平在两组之间无明显差异(P>005)。2、血清E2FAE、E2及血清E2-FAEE2在两组之间差异无统计学意义(P2>O05)。3、血清E2FAE水平与HOMA-IR呈正相关(r-043，P=O02)，E2水平与FBG 呈正相关(仁040，P=003)。3、GDM组皮下脂肪HSL蛋白表达明显低于正常对照组(P-002)。4、皮下脂肪组织HSL蛋白表达与FFA、FINS、HOMA-IR及E2FAE均呈 负相关(r=-

10、065，P-002；r=-070，P=001 r=-059，P=004；r=-056，P=003)。结论1、GDM孕妇存在高胰岛素血症、高胰岛素抵抗和高血中FFA。2、GDM组和正常组血清E2FAE和游离E2水平没有明显差异，但血清E2-FAE水平与HOMA-IR呈正相关。血清游离E2水平与FBG呈正相关，提示血 清E2FAE和游离E2与糖代谢可能存在联系。3、GDM患者皮下脂肪HSL蛋白表达下降，且皮下脂肪组织HSL蛋白表达 与FFA、FINS、HOMA-IR及E2-FAE均呈负相关，提示HSL可能通过脂代谢及 E2FAE的水解，影响胰岛素抵抗，参与GDM发病及发展。关键词妊娠期糖尿病：胰岛

11、素抵抗；雌激素；雌激素脂肪酯；激素敏感性酯解酶；3·英文论著摘要·The correlation between estradiol fatty acid esters and its esterase with gestational diabetesObjectives1、To detect the serum level of the estradiol fatty acid esters(E2-FAE)and free eatradiol(E2)in the gestational diabetes mellitns(GDM)group and control gr

12、oup， and thief correlation with lipid and glucose metabolism2、To determine the expression of hormone-sensitive lipase(HSL)in subcutaneousf缸of GDM group and control group，and to explore the correlation between HSL andlipid and glucose metabolismMate：rials and methods1、SubjectsThe subjects were 31 ter

13、m pregnant women who visited the Shengjing hospital， They were divided into two groups：GDM group and control groupGDM group：age (3329+_589)years，gestational week(3830_+063)week，progestationBMI(2112_+210)kgm2,weight gain in the gestational(1982+401)kgControl group：age (2988+_372) years，gestational we

14、ek(3879_+073)week，progestation BMI (1983+217)kgm2,weight gain in the gestational(1900_+497)kg2、Collection of blood and tissue samplesAfter overnight fasting,a 5一mL sample of blood in EDTA(1 mgmL)was obtained from each woman who volunteered tO participate in the studyThe samples were stored at·8

15、0until analysisSubcutaneous fat Was obtained from cesarean section and then stored at-80until analysisThe study Was approved by the ethicsCommittee，and all the women participating in the study gave informed written4consentbut because the limitation of the select of subcutaneous fat，there was eight G

16、DM subjects provided the subcutancous fat，and 9 control subjects provided the subcutaneous fat3、Measurements and methods(1)The age、gestational week、SBP、DBP、height、progestation weight of the subjects we坨collected from the clinical historyThe fasting blood glucose、total cholesterol、triglyceride、low de

17、nsity lipoprotein、high density lipoprotein、Aim A-I、ApoB were collected from clinical analysis results(2)Serum free fat acid(FFA)was messureed by improved cyclohexane oxalyl dihydrazone colorimetric method,and the level of serum fasting insulin Was messureed by euzymelinked immunosorbent assayInsulin

18、 resistance Was estimated using the homeostatic model assessmentinsulin resistance(HOMA-m)index，calculated as(FBGxFINS)225(3)The concentrations of E2-FAE and free E2 in serum were determined by time·resolved fluoroimmunoassay Cm·F认)The changes of serum E2-FAE and free E2 concentrations in

19、subjects with two groups and the correlation between them and metabolic indicators were analyzed(4)HSL protein levels in subcutaneous fat tissue were analyzed by Western blotThe correlation between protein levels of HSL and metabolic indicators wereperformed3、Statistical analysisAll data are express

20、ed as means_+SEMThe significance of the difference in mean values between GDM group and control group Statistical significance was evaluated using the t testThe correlation analysis USeS the near correlation analysisStatistical significance Was set at a P value of less than 005Resultsl、Serum FINS、HO

21、MA-IR and FFA levels were higher in GDM group than5control group(P-O03，P=0049，P=0oo)The age、gestational week、SBP、DBP、TG、TC、LDL、HDL、FBG、APOA-I、APOB levels didnt differ in tWO groups(P>O05)The results of E2-FAE、free E2 concentrations and the ratios of E2-FAE tO freeE2showed no significant differenc

22、e betWeen tWo groups(P>O05)2、The serum E2-FAE and HOMA-IR positively correlates to each other(r=043， P=002)ne serum concentrations of E2 correlated positively to FBG(芦O40， P-003)3、The HSL protein level in subcutanous fat was lower in GDM group than controlgroup(P=001)4，The HSL protein level corre

23、lated negatively with serum FFA，FINS，HOMA-IR and E2-FAE(r=-065，P-002：r=-070，P=001：r=-059，P=004；r=-056，P=003)。Conclusionl、GDM patients has high insulinemia,high insulin resistance and high levels of眦2、The results of E2-FAE、free E2 concentrations showed no significant difference betWeen GDM group and

24、control group，The$crum E2一FAE and HOMA-IR positively correlates to each otherThe serum concentrations of E2 correlated positively to FBG S0 E2-FAE and free E2 perhaps has closely correlation with glucose metabolism3、The HSL protein level in subcutanous fat Was lower in GDM group than control group，a

25、nd its level correlated negatively with serum FFA、FINS、HOMA-IR and E2-FAE Therefore，HSL protein has closely correlation with lipid and glucose metabolismMay be HSL involved in the incidence and the severity of the GDMKey wordsGestational diabetes mellitus；Insulin resiatance；Estradiol；Estradiol fatty

26、 acidester；Hormone sensitive lipase6·英文缩略语·7·论文·雌激素脂肪酸酯及其酯解酶与妊娠期糖尿病 相关性的研究刖吾妊娠期糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus，GDM)是在妊娠期首次发现或发 生的糖代谢异常，GDM发生率在世界各国报道为1-14i¨。GDM的发病机制并未 完全确定。经典观点认为孕期胎盘生乳素、催乳素、糖皮质激素、雌激素及孕激 素等拮抗胰岛素激素水平的升高及其造成的胰岛素抵抗(Insulin，m)状态是主要 原因12l。雌激素既参与脂代谢，同时又参与胰岛素抵抗，雌激

27、素在脂肪组织中的含量 明显高于血液中的浓度，大约为血液中的十倍左右，而脂肪组织的雌激素多以雌 激素脂肪酯(髂tradiol fatty acid esters，E2FAE)的形式存在I孤。作为一种长效雌 激素，E2-FAE是雌二醇(1radiol，E2)与长链脂肪酸通过酯化作用形成的一类亲脂 性雌激素衍生物【4l。血清中的E2-FAE是E2与脂肪酸在高密度脂蛋I兰t(High density lipopfitein，HDL)协同的卵磷脂一胆固醇酯转移酶催化作用下生成，随后转运到 其他脂蛋白颗粒，如低密度脂蛋白(hlw density lipoprotein，LDL)和极低密度脂 蛋白(Very

28、 low density lipoprotein，VLDL)【51。E2·FAE同游离E2一样在孕晚期妇女血浆中表达增加，大约四分之三的E2FAE包含于脂蛋白 61。目前尚不完全清楚其 在妊娠妇女及非孕妇女体内的生理作用，Shwaery等报道f7uIE2FAEn-I能作为一种 抗氧化剂保护脂蛋白氧化。LDLt办同的E2一岖的浓度增加可能有助于提高u)L抵 抗铜诱导的氧化，而GDM患者经常伴随着脂质代谢异常，以及LDLg化易感性增加f铆，U)嗡化易感性增加可引起胎盘损害进而导致胎儿死亡及胎儿宫内生长受限【lol。高脂血症，雄激素，孕激素，高血糖均可加速LDL-g化，而维生素E，雌激 素

29、则增强U)L的抗氧化能力【1¨。8E2-FAE不能与雌激素及孕激素受体结合，需要水解成游离E2才能发挥其生 理作用。研究显示，激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive lipase。HSL)是负责催 化雌激素脂肪酯及其他甾体激素脂肪酶水解的关键酶【121，HSL也是脂肪分解的限速酶，能水解甘油三酯(Triglyceride，TG)、甘油二酯(Diglyceride，DG)、甘油一 酯、胆固醇酯和其他脂质及水溶性底物，产生甘油和脂肪酸，在整个能量代谢中 发挥着非常重要的作用。其活性受胰岛素调节，胰岛素可以抑锘IJHSL的活性，在m或循环中胰岛素增多时HS龉性下降1131。另

30、外瓜和糖尿病患者游离脂肪酸(Freefat acid,FFA)浓度升高，通过抑制脂肪分解可以降低血浆H划(平，从而改善胰岛素的敏感性【141。因此，E2-FAE作为E2在脂肪组织中的主要表达形式，HSL是水解E2-FAE 的关键酶，也是脂解的关键酶。它们与糖、脂代谢之间可能存在着非常密切的交 互作用。本研究通过检测及比较GDM患者、无妊娠合并症及并发症的单胎孕妇 血清E2一FAE、E2水平及皮下脂肪组织中HSL蛋白水平变化，分析E2-FAE、E2 及HSL与GDM的相关性，进而探讨E2一FAE、E2及HSL在其中的可能的致病机 理。材料与方法一、研究对象选择2010年7月到2011年1月于中国

31、医科大学附属盛京医院住院并分娩的 孕晚期单胎足月孕妇31例为研究对象(孕前体质指数(BMI)=185239 kgm2)。 其中GDM孕妇14例(GDM组)：孕妇年龄(3329±589)岁，孕周(3830±063)周，孕前体重指数(2112±210)kgm2，孕期体重增加(1982±401) kg。正常无任何合并症与并发症孕妇17例(对照组)：孕妇年龄(2988±372) 岁，孕周(3879±073)周，孕前体重指数(1983±217)kgm2，孕期体重增 加(1900±497)kg。GDM诊断标准参照2010年国际

32、妊娠与糖尿病研究组织 (International Association of Diabetes and Pregnancy Study Groups，IADPSG)制定的GDM诊断标准l捌，即OG3T试验空腹、1 h和2 h血糖诊断界值分别为951mmolL、100 mmolL和85 mmolL，三项中任何一项的值达到或超过上 述标准即可诊断GDM。BMI-体重(kg)身高2(m2)，参照2001年中国肥胖问 题工作组制定的中国成人体质指数分类建议1161，BMI 18-239 kgm2为正常体重。二、研究方法 (一)一般资料 孕妇年龄、分娩孕周、孕产次、收缩压、舒张压、身高、体重等基本信

33、息从住院病历及询问病史中获得，空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)，血清总 胆固醇(Total cholesterol，TC)、TG、LDL、HDL，载脂蛋白A-I(Apo A-I)， 载脂蛋白B(ADo B)等指标从患者住院化验结果中获得。(二)标本的采集与处理各组孕妇入院后空腹812小时，于次晨抽取肘静脉血5ml，于3000转分， 离心10分钟提取血清，血清分装后置于一踟冰箱保存备用，待测量E2-FAE、 E2、空腹胰岛素(Fasting insulin，FINS)及FFA。皮下脂肪标本于剖宫产手术中采集，立即放入液氮罐并转运到一80低温冰箱保存备用，待测定HSL

34、蛋白表达。该研究得到中国医科大学伦理委员会批准同意，每位参加研究的孕妇均签订知情 同意书。由于收集皮下脂肪组织有一定限制，GDM组收集皮下脂肪组织8例，正 常组收集皮下脂肪组织9例。(三)实验材料1、主要仪器设备(1)测量雌激素的时间分辨荧光免疫分析仪器分别为由DELFIA洗板机、 DELFIA摇板机以及多标记检测仪(CTOR 1420 MULTILABEL COl腻TER)， 同时配备时间分辨荧光测量的分析软件(芬兰Wallac公司)(2)液体闪烁计数仪(Rack-Beta,芬兰Wallac公司) (3)一20和一80低温冰箱(日本三洋公司) (4)真空干燥机10(5)离心机BIOFUGE(

35、美国基因有限公司) (6)恒温金属浴(杭州博日科技有限公司) (7)酶标仪(8)水浴锅 (9)电泳仪 (10)超声粉碎器 (11)化学发光显影仪2、雌激素和对照样本(1)雌激素(1713一雌二醇和1713一雌二醇硬脂酸酯)由Steraloids公司购买，4保存。 (2)氚标记的雌二醇双油酸由化学方法合成，原材料为氚标记的雌二醇和油 酸氯合成。 (3)对照样本由男性血清池添加雌二醇硬脂酸组成，分别为低、中、高浓度 (相对应的E2浓度为110 pmolL、257pmol598皮pmol)。其浓度由分光光度测定法和气相色谱一质谱联用仪确认，一20保存备用。3、有机溶剂和试剂(1)甲醛，己烷，醋酸乙酯

36、，为HPLC纯(Rathburn，Chemicals Ltd)(2)二乙醚为蒸馏纯(Rathburn,Chemicals Ltd)(3)氯仿(Merck)(4)葡聚糖凝胶LH一20(Amersham Pharmacia Biotech AB)(5)Sep-Pak C18柱(Waters Corp)(6)Lipidex 5000，甲醛混悬液内，4保存(Packard Instrument Company) (7)TrisHCI缓冲液 (8)雌激素时间分辨荧光免疫分析盒(芬兰Wallac公司) (9)FFA超敏测定试剂盒(普利莱基因技术有限公司)(10)蛋白提取所用试剂 Western及口细胞裂解

37、液(碧云天)11BCA蛋白弄测定试剂盒(碧云天)PBS：KCh 014克，KH2P04：01359，NaCI：409，NaHP04-12H20：09879(11)Western所用试剂SDSPAGE：分离胶缓冲液15M TrisHCI PH88：Tris：18159加50ml蒸馏水，浓盐酸 调PH至88，再加水至100ral浓缩胶缓冲液10M TrisHCI PH68：Tris：12109加50ml蒸馏水，浓盐酸 调PH至68，再加水至100ml30Acrbis：丙烯酰胺：299NN双丙烯酰胺19溶于60ml蒸馏水中，37"C 水浴至溶解，补水至体积为100ml，避光4"C

38、保存。10SDS：SDSlog加蒸馏水90ml，68水浴至溶解，补水至100ml10APS：APSl00mg，加蒸馏水lml，现用现配 TEMED：实验室提供5X loading buffer(蛋白上样缓冲液)：碧云天 电泳缓冲液(10X)(running buffer)：Tris：15159 Glycine：729 SDS：59，加蒸馏水至500ml，用时取100ml加入900ml蒸馏水，即为1x电泳缓冲液 转膜缓冲液(10X)(trancferbuffer)：Tris：15159 Glycine：729加蒸馏水至500ml。用时取100ml加入700ml蒸馏水，200ml甲醇。 洗膜液(1

39、0X)(TBST)：Tris：1219NaCh 409，加蒸馏水至500ml，用时取100ml加入900ml蒸馏水，加lmlTween-20(现用现加)。Marker：Fermentas公司封闭液：5脱脂牛奶：5 g脱脂牛奶加1XTBST 100ml。一抗：HSL总蛋白抗体：兔抗人多克隆抗体，Santa公司，1：700稀释。GAPDH 内参(36KD)：鼠抗人单克隆抗体，Santa公司，1：10000稀释。二抗：山羊抗兔辣根氧化酶标记IgG：北京中杉金桥公司1：2000稀释。山羊 抗小鼠辣根氧化酶标记kG：北京中杉金桥公司1：2000稀释。ECL发光液：碧云天，用时A、B液各lml混合。(四)

40、血清生化指标的测定酶联免疫法测定FINS水平(试剂、仪器均为美国贝克曼公司产品)，胰岛素 抵抗评价采用稳态模型评估法一胰岛素抵抗指数 (Homeostatic model assessment-insulimesistancc，HOMA-IR)=FINSX FBG225，改良铜试剂比色法测定血清 HA水平。(五)时间分辨荧光免疫分析测定血清E2-FAE、E：1、实验原理应用TR-FIA同时测定皂化的血清E2-FAE、E2。本方法由一系列的层析法和 最后一步的TR-FIA组成。首先，采用有机溶剂萃取血清中的E2-FAE、E2。随后， 采用层析法分离E2-FAE、E2。将E2一FAE皂化和洗涤，去

41、除血清中的可能脂质干 扰物后，连同游离E2素一起测量。2、实验步骤(1)萃取质量控制样品包括lml的水和低、中、高浓度的对照样品(添加 了雌二醇硬脂酸的男性血清，相应的E2浓度为llOpmolL、257pmolL和598 pmolL)。取lml患者血清连同质量控制样品，加入氚标记的雌二醇双油酸内参之后(2600-3500 dpm，以确定每个样本的回收率)分别加入25ml的乙醚：乙酸乙酯(1：1，体积：体积)萃取，混合3分钟后在干冰乙醇浴中将无机相凝固， 收集仍为液体的有机溶剂相。共萃取4次，所收集的有机溶剂相合并之后在真空 干燥机中干燥，一20保存到下一步分析。(2)葡聚糖凝胶LH-20柱层析

42、法分离E2一FAE、E2葡聚糖凝胶LH-20柱 (05emx5cm)，将萃取之后的样品溶解于300 ul的己烷：氯仿(1：1，体积： 体积)混合液中，涡旋后上样到LH一20柱层析上，盛样品的试管用300ul的己烷： 氯仿混合液(1：1，体积：体积)洗两次，洗涤液也加样于I-1-20柱层析。用6ml 己烷：氯仿混合液(1：1，体积：体积)洗脱E2-FAE并收集。随后，改为5ml 甲醛洗脱非酯化的游离E2。E2-FAE和游离E2分别在氮气下蒸发至干燥，将所有 样本溶解于lml甲醛溶液中，游离E2保存于4直到测量，E2一FAE则进一步皂 化。(3)皂化在氮气下将E2一FAE蒸发至干燥，加入lml氢氧

43、化钾(1 molL)，在60恒温箱内孵化2小时。加入lml蒸馏水，260ul盐酸(4 molL)，混合后 在氮气下蒸发至约lml液体剩余。(4)Sep-Pak C18柱SopPak C18柱预先用8ml甲醛以及lOml水洗涤，加 lOml蒸馏水于皂化后的样品中，混合后将其上样于C18柱，先用15ml水清洗， 然后改为6ml甲醛洗脱并收集洗脱液，所得样本在氮气下蒸发至干燥，加入lml 甲醛后于4保存。(5)Lipidex 5000反相柱层析法应用Lipidex 5000反相柱层析法(05em X5era)清洗样品中的TC和其他脂质杂质。样本被溶解于260ul甲醛：氯仿：水(8：2：2，体积：体积

44、：体积)混合液中，上样于Lipidex 5000反相层析柱，试管用260ml甲醛：氯仿：水(8：2：2，体积：体积：体积)混合液洗涤2次，均上样 于Lipidex 5000反相层析柱，随后用4ml甲醛：氯仿：水(8：2：2，体积：体积： 体积)混合液中洗脱，收集所有的洗脱液，氮气下蒸发至于燥后保存于lml甲醛(4)。(6)Sephadex LH-20柱层析方法基本与步骤(2)相同，葡聚糖凝胶LH一20 柱(O5cmX5cm)，将样品溶解于300ul己烷：氯仿(1：1，体积：体积)混 合液中，涡旋后加样到LH一加柱层析上，盛样品的试管用300ul的己烷：氯仿(1：1，体积：体积)混合液洗两次，洗

45、涤液也加样于LIt-20柱层析。用6ml己烷： 氯仿(1：1，体积：体积)混合液洗脱脂溶性杂质，随后，改为5ml甲醛洗脱并 收集水解的E2-FAE。水解的E2一FAE在氮气下蒸发至干燥后溶解于lml甲醛，保 存于4直到TRFIA测量。(7)TRFIA测定水解的E2一FAE和游离E2的浓度样品蒸发至干燥后溶解于 实验缓冲液中，为了得到较好的精确性(所得的数值在标准曲线的线性区域)， 相较于起始体积的样品，游离E2稀释100倍，而水解的E2一FAE不用稀释。整个 实验过程的回收率由液体闪烁计数仪测得。标准品为1151836pmolL，由E2储液经实验缓冲液系列稀释配制。E2储液的浓度由分光光度测定

46、法确认。TR-FIA 定量实验的步骤与试剂盒中的为商业时间分辨荧光免疫分析试剂所校正的推荐步 骤相似，仅E2抗血清和铕示踪剂溶液相较推荐步骤多稀释50。(六)Western blot半定量法测定皮下脂肪HSL的蛋白表达141、脂肪组织中总蛋白的提取先用PBS洗去脂肪组织的血，约200rag脂肪组织加lml裂解液置于15ml离心管中，剪子剪碎，超声充分粉碎，于412裂解30分钟，然后再412，13，000×g，离心30分钟。用注射器将脂肪块和颗粒之间的上清液转移到另外一个离心管 中，即为蛋白样品。2、蛋白含量的测定(1)从一20"C取出05mgmlBSA，室温融化后，备用。

47、(2)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加入到96孔板的标准孔中，加标准品稀释液(PBS)补足到20ul。 (3)加lul样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液(PBS)补足到20ul。各孔加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。酶标仪测定597nm处OD值，绘 出标准曲线，并计算浓度。3、SDSPAGE电泳 (1)清洗玻璃板，用蒸馏水冲洗玻璃板，并晾干。 (2)灌胶与上样玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。先配制8分离胶15mh H20：69 ml，30 Acthis：4ml，15 M TrisHCI-38ml，10SDS：015 ml，APS：015

48、ml，TEMED：0009ml，加1-2cm水层，静置30分钟， 倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配5的浓缩胶10ml，H20：68ml，30 Acrbis：17ml，10 M"Iris-HCh 125ml，10SDS：01ml，APS：01ml，TEMED：001ml，插入梳子。静置20分钟待胶完全凝固后，将凝胶按要求安放在电泳槽中。 将电泳缓冲液加入两板胶之间，轻轻水平缓慢拔出梳子。上样：Marker 5ul，每 孔70mg总蛋白。根据测得的蛋白浓度计算含70rag蛋白的溶液体积即为上样量。 上样前将样品于金属浴中100加热5分钟使蛋白变性。空余泳道用1X上样缓冲 液补齐。(3)

49、电泳浓缩胶80伏，分离胶100伏，电泳时间为4"-5小时，至溴酚兰 刚跑出即可终止电泳，进行转膜。4、转膜(1)膜准备预先裁好与胶条同样大小PVDF膜，甲醇浸透5分钟后转膜缓 冲液浸透30分钟；三明治装置中的海绵垫，滤纸用转膜缓冲液浸透。(2)切胶按照Marker标记的分子量切胶(72KD95KD，34KD-43KD)。 (3)转膜(湿转)按照阴极一海绵一滤纸(2层)一凝胶一PVDF膜一滤纸 一海绵一阳极的顺序铺好胶和膜，注意不要有气泡，安放好三明治的转运槽。转膜条件为100伏，60分钟。5、封闭将膜从电转槽中取出，洗膜液稍加漂洗，HSL总蛋白和GAPDH内参用5脱 脂奶粉封闭1小时

50、。6、一抗孵育用5脱脂牛奶按1：700比例稀释HSL总蛋白抗体。GAPDH抗体用5脱脂奶 粉按1：10000比例稀释，4摇晃过夜。7、二抗 (1)用1X洗膜液洗膜，洗涤5分钟，共洗涤4次。 (2)根据说明书用TBST按1：2000比例稀释加入辣根过氧化物酶标记(Hl心)的二抗，室温摇晃1小时。8、化学发光 (1)用1X洗膜液洗膜，洗涤5分钟，共洗涤4次。 (2)配发光液：A、B各取05毫升充分混匀。 (3)将膜放于玻璃板上，置于发光仪中，A、B混合液滴于PVDF膜上，熄灯，可调放光时间为3分钟，10分钟，可出现目的条带。9、凝胶图象分析图片扫描保存为电脑文件，并用Image J分析软件将图片上

51、每个特异条带灰 度值的数字化。目的蛋白的灰度值除以内参GAPDH的灰度值以校正误差，所得 结果代表某样品的目的蛋白相对含量。16三、统计学分析采用SPSSl70统计软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差(x±s) 表示，两组问比较采用t检验，相关分析采用直线相关分析。以P<005为差异有 统计学意义。结果一、临床资料、生化指标、血清E2-FAE及E：比较GDM组的FFA、FINS、HOMA-IR均明显高于正常对照组(P<O05)，而 年龄、孕周、孕前BMI、孕期体重增长、SBP、DBP、TG、TC、LDL、HDL、ApoAl、 ApoB、FBG在两组差异无显

52、著性(P>o05)，E2一FAE、E2、E2-FAE与E2的比率在两组差异无显著性(P>o05)，详见表1。表1，GDM孕妇与正常对照组孕妇一般情况及生化指标比较(x±s)17二、血清E2_FAE及E：浓度与血清生化指标的相关性血清F_a-FAE水平与HOMA-IR水平呈正相关(相关系数r-O43，P=O02)。 血清E2水平与FBG水平呈正相关(相关系数r=O钧，P=003)，详见表2。表2，血清E2-FAE及E2与糖、脂代谢指标的相关性分析三、皮下脂肪HSL在两组间的表达GDM组皮下脂肪中HSL蛋白表达明显低于正常对照组(P<005)，详见表3 及图118表3,

53、GDM组与正常对照组皮下脂肪组织中HSL蛋白表达(x士s夕乞 5·_HSL(84KDa)2L 5GAPDH(36KD)1一-·吼 5正常组GDM组*棚傅袈晕皿嘲-l冒景匿0图1，GDM组与正常对照组皮下脂肪组织HSL蛋白表达四、皮下脂肪HSL蛋白表达与血清生化指标的相关性皮下脂肪组织HSL蛋白表达与FFA、FINS、HOMA-IR及E2一FAE均呈负相 关(P<005)，详见表4。表4，皮下脂肪组织HSL蛋白表达与糖、脂代谢指标的相关性分析19讨论一、E：在GDM孕妇的可能作用GDM是妊娠期间最常见的内科合并症之一，近年来发病率有逐年升高的趋 势。GDM的发病机制还不是很清楚。由于妊娠期各种激素的抗胰岛素作用，以及 孕妇体质量增加、体内脂类集聚，妊娠期出现生理性瓜状态，这种抵抗作用于孕24_28周快速增强，32-34周达到高峰，有助于胎儿的营养供