细胞工程期末复习资料

1、细胞工程第一章 论绪1、细胞工程：按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。(1)分类a.按生物类型分为：动物细胞工程、植物细胞工程、微生物细胞工程b.按实验操作对象分为：细胞与组织培养、细胞融合、细胞核移植、染色体操作、转基因工程。(2) 操作水平：细胞整体水平或细胞器水平(3) 目的：定向改变遗传物质或获得细胞产品(4) 理论基础：细胞全能性(5) 依据：生物体的每一个干细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。2、 植物细胞工程包括：植物体细胞杂交、植物组织培养。3、 动物细胞工程包括：动物细胞融合

2、、动物细胞培养、单克隆抗体技术、核移植、胚胎移植。4、 细胞工程研究内容(1) 细胞与组织培养（离体培养）：是细胞工程的最基本技术。(2) 细胞融合（细胞杂交）：自然融合、人工诱导融合。j试管婴儿k单克隆抗体技术(3) 细胞核移植：克隆羊多莉(4) 染色体工程：多倍体育种(5) 胚胎工程：以生殖细胞和胚胎细胞为对象，包括体外受精、胚胎移植、胚胎切割。(6) 干细胞与组织工程：胚胎干细胞、组织细胞。人工培养的肌肉、器官。5、 细胞工程的应用：a. 快速繁殖b. 种苗脱毒c. 动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种d.利用动植物细胞培养生产活性产物、药品（生物反应器工程），如利用动物细胞融合形成单克隆

3、抗体，利用植物细胞培养次生代谢产物。e.新型动植物品种的培育f.供医学器官修复或移植的组织工程g.珍稀动植物资源的保存与保护h.在遗传学、发育生物学领域的理论研究第2章 细胞全能性与形态发生1、名词解释：u细胞全能性：细胞经分裂和分化后仍具有形成完整个体的潜能或特性。v极性：指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。w离体器官发生：培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。x细胞分化：导致细胞形成不同结构或引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。y脱分化：离体培养条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂，逐渐失

4、去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织，或成为未分化细胞特性的过程。z再分化：离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官、甚至形成完整植株的过程。胚状体：在植物组织培养中，起源于一个非合子细胞、经过胚胎发生和胚胎发育过程形成具有双极性的胚状结构，叫做胚状体或体细胞胚胎。|愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分裂产生无组织、无明显极性的松散的细胞团。2、植物的再生途径：植物再生的各种途径，与实验材料和培养基、添加的激素有关。3、 愈伤组织的种类：a. 胚性愈伤组织：表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。易形成胚状体，所

5、以被称为胚性愈伤组织。b. 非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、细胞大。4、 不定根：从茎、叶上生出的根叫做不定根。不定芽：不是从叶腋或枝顶发出，而是从叶子、根上或从树干上发出的芽。5、 离体培养中通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式：a. 先芽后根；如小麦，芦荟、苹果。b. 先根后芽；如枸杞、苜蓿等。c. 在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。如胡萝卜、石刁柏。第3章 植物细胞工程常规技术1、 细胞工程实验室一般由培养基制备室、无菌操作室、培养室、显微观察室和移栽驯化室。其中培养基制备室由洗涤间、制备间和消毒间3部分组成；无菌操作室通常由里外两件组成，外间

6、是缓冲间，用于准备工作，内间是接种间，用于接种；培养室可分为光照培养室和暗培养室。2、 常用的洗涤液类型（5种）：铬酸洗液、碱性高锰酸钾洗液、磷酸钠洗液、硝酸-过氧化氢洗液、强碱洗液。3、灭菌的方法：1) 物理方法：干热、湿热、过滤(0.25微米）、紫外灯、超声波等。2) 化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等。a. 干热灭菌：适用于玻璃器皿和金属器械。操作时间：j150，40min k120，120min160，90-120min（芽孢杆菌）b. 湿热灭菌：适用于各种器皿、培养基、蒸馏水、棉塞、纸。操作时间：j120，20-30minc.

7、过滤灭菌：适用于某些生长因子、赤霉素、酶液、血清、玉米素、脱落酸、尿素、维生素。d. 射线灭菌：适用于实验室操作台。操作时间：j2030mine. 火焰灼烧灭菌：适用于接种器皿。f. 消毒剂：适用于外植体、实验器皿、操作表面、皮肤。4、外植体：指无菌条件下，离体培养于人工培养基上的、用于达到某种培养目的的原始植物材料。5、外植体消毒方法： 取材后将老的组织去掉自来水冲洗洗衣粉水洗（简单杀菌）自来水冲洗70酒精处理消毒剂处理 灭菌蒸馏水冲洗35遍。 其中，消毒时采用的消毒剂及其浓度处理时间等，均应根据材料的情况及对消毒剂的敏感性来定；消毒时间因植物老嫩程度不同而不同，一般，较老的材料相对杀菌时间

8、长，反之较短。 消毒剂种类有很多，如次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔姆林等。次氯酸钠效果应该比较好，无毒、无污染、但往往由于储藏、运输过程中不注意，见光氧化，影响杀菌效果。一般多用升汞。 一般杀菌，酒精10秒，升汞512分钟。6、 外植体的选择：P46 用于外植体分离的母体植物材料一般有3种来源：一是生长在自然环境下的植物；二是在温室控制环境条件下生长的植物；三是无菌环境下已经离体培养过的植物。（1）选择优良的基因型 试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的材料，并且品种一定要可靠。花卉、观赏

9、植物的快繁，也应选择有价值的植物。 （2）取材 从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母株代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容易成功。（3）外植体大小选择 因外植体不同而不同。如利用茎尖培养，茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，胚龄也非常重要。 （4）选择外植体的时期 外植体的生长动态往往与该物种的生长规律（生物钟）有关。因此，最好在植物生长的最适宜时期取材培养。会得到较好的结果。7、外植体的处理：（1）取材母株的预处理 人工管理，促进母株生长旺盛、代谢活跃，从其上取材培养，容易成功。 （2）外植体休眠的处理 有些植物的种子、幼胚、或芽，存在休眠。为了打破休眠，可利用低温处理，或赤

10、霉素等化学物质处理。因植物不同处理温度和时间有所不同。 （3）外植体的灭菌 大田或温室植物材料，都带有大量的细菌和真菌，这是组织培养的一大障碍，所以材料必须进行杀菌消毒（表面杀菌）组织内生菌的处理（1）加入抗生素，注意抗生素的用量，高浓度容易造成培养物的死亡 （2）取生长期旺盛的生长点部位作为起始培养的外植体。 （3）取被内生菌污染的培养物的茎尖不停的转接。8、 培养基的组成和作用（1） 无机营养j大量元素：N（硝酸盐或铵盐）, P, K ,Ca, Mg, Sk微量元素：Fe, Mn, Zn, Mo, Cu, Cl（2） 有机营养（1） 维生素类物质j硫胺素（VB1）：愈伤组织的产生和生活力有

11、关k烟酸（VB3、维生素PP）：促进胚的发育盐酸吡哆醇（VB6）：促进根的生长其它：泛酸钙（VB5）、生物素（VH）、钴胺素（VB12）、叶酸（VBc）（2） 氨基酸类物质j甘氨酸（Gly）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）k水解乳蛋白、水解酪蛋白（3） 糖类j蔗糖（植物）、葡萄糖（动物）、果糖、麦芽糖k作用：为细胞提供合成新物质的碳骨架；为细胞的呼吸代谢提供底物和能量；维持渗透压。（4） 其它有机物质j肌醇：细胞壁的构建物质；参与细胞膜的组成；利于胚和芽的形成。k天然有机物：椰乳、番茄提取物、酵母提取物。（3） 植物生长调节物质（1） 生长素类j吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、

12、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）k作用：a.促进细胞生长和细胞分裂 b.诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力 c.形成愈伤组织，促进生根 d.与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体 的诱导。（2） 细胞分裂素jKT/KIN、6-BA（最常用）、ZT（玉米素）、ZIPk作用：a.促进细胞的分裂和分化 b.诱导芽的分化 c.促进侧芽的萌发和生长 d.抑制衰老分裂素/生长素比例高时产生芽,比例低时产生根（3） 赤霉素（GA3）不耐热，应采用过滤灭菌j作用：a.诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效 b.对形成层的细胞分化有影响，往

13、往同生长素有协同作用。IAA/GA比值高有利于 木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化。 c.破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。 d.对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用（4） 脱落酸（ABA）j作用：a.抑制蛋白质的合成 b.抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GA的作用 c.诱导休眠、促进衰老和脱落（4） 附加物常用的附加物：琼脂、活性炭、琼脂糖、天然复合物（椰乳、酵母提取物等）等。9、 培养基的种类（按无机盐浓度不同）（1） 高无机盐含量培养基j钾盐、铵盐和硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。kMS、LS、BL、BM、

14、ER培养基。（2） 高硝态氮培养基j含较高的硝酸钾和VB1，氨态氮的含量低，适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。kB5、N6、SH培养基（3） 中等无机盐含量培养基j大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较MS的高，维生素种类比MS多，如增加了生物素、叶酸等。适合于花药培养。kNitch，NT、H、Miller培养基（4） 低无机盐含量培养基j大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量相对也很低。多数用于生根培养基。k White、Heller、WS、HE、HB培养基10、 初代培养：指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养：指用来接种继初代培养物的培养

15、基。11、 根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。基本培养基（就是通常称呼的培养基）：主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。完全培养基：在基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。12、培养条件的选择1 光照：培养中光照主要表现在光强、光质、以及光周期等方面。 a.光周期的需要与否，应根据植物种类、培养的目的来决定。最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依据植物种类不同做法不同，多数植物适合全暗或周

16、期性光照；器官发生阶段：一般给予周期性光照比较好。 b.光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。高光量可以降低植物体内生长素水平，低光量使植物体内生长素素水平较高，容易生根 离体培养条件下常用的光量，一般为1000-4000lx（勒克斯）。离体培养中通常难以达到4000lx，一般光量在2000-3000lx。 c. 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。 离体培养条件下，一般用日光灯进行光照，光谱成分主要是蓝紫光，波长为419-467nm。对芽分化有效光谱成分为蓝紫光，根分化则受600-680

17、nm所刺激。2 温度：培养都是在2327之间进行，一般采用25±2。3 湿度：组织培养中湿度的影响有两个方面：a.培养容器内的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。 b. 环境的湿度条件。环境的相对湿度一般要求7080%。常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。4 PH值：不同的植物对培养基最适PH值的要求是不同的，大多在5.5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8。 一般来说pH值高于6.5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低pH值（约0.2-0.3个pH值）因此在配制时常提高pH值0.2-0.3单位。5 渗透压：通常1-2个大气压对植物生

18、长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。渗透压调节物质：糖、甘露醇、山梨醇 培养基各种物质中，糖对培养基渗透压起决定性作用。因此调节渗透压往往从调节糖浓度着手。糖除了作为渗透压调节物质外，还是培养基重要的碳源和能源。另外，甘露醇，山梨醇等也可以作为调节物质。 6 气体：氧气是培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振

19、荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。 13、 褐变：在植物组织培养中，外植体在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐变的主要原因：植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。 生理状态 由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组

20、织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。 培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。 培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。褐变的防止措施：选择合适的外植体。一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 对外植体进行预处理。对较易褐变的外植体材料进行预处理可以减轻酚类物质的毒害作用。选择适宜的培养基与培养条件。无机盐成分、适宜的蔗糖浓度及激素水平、适宜温度、在黑暗条件

21、下进行培养、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。添加褐变抑制剂与吸附剂。褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO的抑制剂，还原剂如抗坏血酸、半胱氨酸等，均能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。改变培养方式。进行细胞筛选和多次转移。在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可剔除易褐变的细胞。14、 玻璃化苗：植物组织培养中出现的呈半透明状的、畸形的试管植物，它不能移栽成活于土壤或其他基质中。当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下

22、降。玻璃化为试管苗的生理失调症。 克服玻璃化苗的防范措施：j适当控制培养基中无机营养成分，减少培养基中的氮素含量。k适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度。适当提高培养基中蔗糖的含量，可降低培养基的渗透势，减少外植体从培养基中获得过多的水分。而适当提高培养基中琼脂的含量，可降低培养基的供水能力，造成细胞吸水阻遏，也可降低玻璃化。适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度。增加自然光照，控制光照时间。控制好温度。热激处理可防治玻璃化的发生。改善培养器皿的通风。增加容器通风，降低瓶内湿度及乙烯含量，改善气体交换状况，如使用棉塞、滤纸片或通气好的封口膜封口，可有效防治试管苗玻璃化。在培养基中添加其他物质，如添加间苯

23、三酚或根皮苷，可有效地减轻试管苗玻璃化。第4章 植物脱毒与离体无性繁殖技术1、 名词解释：j植物离体无性繁殖技术：利用离体培养技术，将来自优良植物的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传性一致植物的技术。k植物脱毒技术：利用植物茎尖组织培养，结合血清学病毒检测技术，在防蚜传毒条件下，将影响作物正常生长的植物病毒全部脱除的高新农业技术。茎尖培养脱毒：采取茎尖分生组织离体培养获取无病毒试管苗的方法。植物器官发生：离体培养的组织或愈伤组织分化成不定根、不定芽等器官的过程。植物细胞脱分化：已有特定结构和功能的植物组织的细胞，在一定条件下被诱导改变原有的发育途径，逐步

24、失去原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚型细胞的过程。外植体：无菌条件下，离体培养于人工培养基上的、用于达到某种培养目的的原始植物材料。P45 （植物体上切下来的进行培养的部分组织或器官 P74）无性系：一个品种通过无性繁殖可产生在遗传上等同的多个拷贝，其中由一个个体通过无性繁殖产生的一个群体称为一个无性系。2、植物组织培养的一般过程：（1） 材料的制备j植物材料（外植体）的制备：材料必须完全无菌，即植物组织必须先进行消毒；外植体大小和形状一般没有严格要求。k培养基的准备：MS培养基（基本培养基）（2） 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导形成可分为诱导期、分裂期和分化期。j诱导期的长短由植物种类、

25、外植体生理状况和外部因素（光照、外源激素）决定。 诱导期特点：代谢活化了，细胞内的合成代谢加强，但是细胞大小和外植体一样，没多大改变。k分裂期特点：外层细胞进行分裂，中间细胞常不分裂，细胞数目增加，体积变小，细胞核和核仁增到最大。分裂期特点：细胞分裂基本停止，细胞平均大小相对稳定，细胞内发生生理代谢等变化而开始形成一些不同形态和功能的细胞。 根据形态变化把愈伤组织的形成分为3个时期，但实际上它们并不是严格区分的，特别是分裂期和形成期往往可以出现在同一块组织上。 虽然细胞脱分化的结果在大多数情况下是形成愈伤组织，但这绝不意味着所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。相反，脱分化后可直接分化为胚

26、性细胞而形成体细胞胚。（3） 继代培养继代培养：愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程称为继代培养。 如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化，产生新的结构。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分化的增殖状态，即可无限制地进行细胞分裂，维持其不分化的状态。（4） 愈伤组织的分化在愈伤组织培养物中，细胞分裂常以无规则方式发生，并产生无明显形态或极性的无序结构组织块，这时虽然在愈伤组织中发生了细胞分化，形成维管化组织和瘤状结构，但并无器官发生。只有满足某些条件，才可从愈伤组织发生再分

27、化而产生苗或根的分生组织，甚至胚状体，进而使它发育成苗或完整植株。在组织培养中，从外植体形成器官或无性系的形态发生，有两种方式：j不定芽方式：细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞核组织培养中常见的器官发生方式。k胚状体方式：由培养细胞诱导分化出的具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株（5） 生根培养当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能及时将培养物转到生根培养基上去，就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。根培养是使无根苗生根的过程，这个过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。生根培养基：1/2或者1/4MS培养

28、基，全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素(NAA、IBA等)。（6） 试管苗驯化与移栽试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度近100%的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很大的差异。所以必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，保证试管苗顺利移栽成功。j移栽前炼苗k移栽和幼苗的管理a. 保持小苗的水分供需平衡b. 防止菌类滋生c. 一定的温度、光照条件d. 保持基质适当的通气性3、 快速繁殖：指利用组织培养的方法，使植物的部分器官、组织在人工

29、控制的适宜条件下，迅速扩大培养，并移植到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。(1)种类：植物组织培养快速繁殖、全光照育苗法、根茎扦插法(2)特点：j繁殖速度快；k使用材料少，生产效率高，省时省工；节约空间有利于植物的工厂化生产；在无菌条件下进行，不受病虫害侵害。(3)用途：j加速某些难繁或繁殖速度低的植物，特别是一些珍稀名贵的花卉，需要发展的濒危植物的繁殖。k用有性繁殖的方法难以保持品种特性的异花授粉植物，如油棕、猕猴桃、非洲菊等。需要去除病毒的植物。原种很少，生产上又急需推广的植物。(4)过程：无菌培养物的建立、芽的增殖、诱导生根、试管苗的移植。a.外植体的选择：外植体选择首先决定于第二阶段

30、芽的增殖所采用的途径。j通过腋芽的形成来增加芽的数量时，应从带有营养芽的部分得到外植体，如：u普通茎尖、芽或带芽的茎切段（非脱毒繁殖）v芽已膨大但芽鳞片还未张开时最为合适w取顶芽或上部的芽作为分生组织或茎尖培养（草本植物如菊花）x使用部分返幼阶段或年龄较低的根蘖苗或不定芽（多年生的木本植物）k通过不定芽途径使芽增殖时，可根据不同的植物采用不同的外植体，如根、茎、叶或花器官的各部分，在自然界中能够产生不定芽的器官应当首先被采用。使用体细胞胚胎发生途径使芽增殖时，常使用胚分生组织或生殖器官作为外植体。b.外植体的消毒c.芽的诱导及增殖：增殖的3条途径：a.通过腋芽的形成和生长b.外植体或愈伤组织上

31、不定芽的形成c.胚状体发生由于外植体种类的不同，在增殖时可能采用的途径不同。j促进腋芽的形成和生长：细胞分裂素，但生长素过多易导致愈伤化。k诱导不定芽的形成：加入适当的细胞分裂素和生长素。诱导胚状体的形成：在自然界只有少数植物可以通过体细胞胚胎发生而产生胚状体，先加入2，4-D诱导胚状体的发生，后转移到降低浓度至无生长素的培养基上使胚状体成熟和生长。d.根的诱导：使第二阶段通过腋芽生长和不定芽形成途径得到的嫩枝生根产生小植株，以便移栽。u剪下无根苗转接到生根培养基中，如MS、B5、White等培养基，都可用于诱导生根，但是其含盐浓度要适当加以稀释。注：j除White外，都富含N，P，K盐，它们

32、都抑制根的发生。因此，应将它们降低到1/2，1/3或1/4，甚至更低的水平。k生根培养基适当加大生长素的浓度，不用或少用细胞分裂素，生长素浓度在0.1-10mg/l，使用较多的是NAA，其次为IAA和IBA，生长素浓度过高时容易引起愈伤组织化和抑制根的生长。培养基中蔗糖的浓度降低到1.0-1.5%，以增强植株的自养能力。培养基不宜过硬以免影响生根，可在培养基中加入1%左右的活性碳。为提高小植株的光合能力，可将光强度增加到3000-10000lux，光周期可用24小时光照或16小时，8小时黑暗以利于光形成建成。v对较难诱导生根的植物，可先半无根苗浸泡在高浓度生长素（100mg/L）的无菌水中几小

33、时到1天，用无菌水洗净生长素后再接种到生根培养基。或在生根培养基中加入适量的根皮苷或根皮酚（间苯三酚）以促进根的形成，浓度约150 mg/L。w嫁接到根系发达、抗逆性强的合适砧木上，如三倍体西瓜苗接到瓠子上。e.移栽4、 脱毒的方法：(1) 热处理法a. 原理：根据病毒与寄生细胞对高温的忍耐程度不同，选择适当的温度和处理时间，植物组织中的很多病毒被部分地或完全地钝化而可控制其活动，但很少伤害甚至不上火寄主组织，从而让植物细胞加快生长，使生长点附近不带病毒，从而达到脱毒的目的。b.方式：j50左右的热水浸泡30mink35-38热空气处理14-28h或更长变温处理，32和38每隔8h变换一次。(

34、2) 抗病毒药剂法a. 原理：抗病毒药剂在三磷酸状态下会阻止病毒RNA帽子结构形成而达到除去病毒的效果。b. 常用抗病毒化学药物：病毒唑、5-二氢尿嘧啶（DHT）、DA-DHT(3) 花药培养法、茎尖嫁接脱毒法、愈伤组织培养法、胚珠培养法5、 脱毒苗的鉴定j植株直接测定法 k指示植物法 抗血清鉴定法 电镜检测法 酶联免疫鉴定法6、 茎尖培养脱毒原理：植物体内病毒靠维管束系统移动，分生组织中没有维管束存在，病毒只靠胞间连丝移动，速度很慢，难以追上生长活跃的分生组织，所以旺盛生长的根尖、茎尖一般都无病毒或很少有病毒分布。7、 在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大又不能保证完全除去病毒；不同

35、种类的植物和不同种类的病毒在茎尖培养时切取的茎尖大小也不相同。一般切取0.2-0.5m带1-2个叶原基的茎尖进行培养即可。第5章 单倍体诱导和染色体加倍1、 花药培养：是指用植物组织培养技术，将花粉发育到一定阶段的完整花药，通过无菌操作技术，接种到人工培养基上，诱导形成单倍体再生植株。（属于器官培养范畴）2、 花药培养的基本程序：外植体选择外植体（花蕾）预处理外植体消毒-剥取花药-接种-诱导培养-分化培养-植株再生。3、 花药培养的方法(1) 花药培养材料的选择：花药培养材料的选择关键在于选取花粉处于一定发育期的花药。一般来讲，外观上从现蕾初期到开花初期的成功率较高；解剖上，处于四分体时期到单

36、核期或单核靠边期为好。(2) 材料灭菌：采集花蕾最好从健壮无病植株中选材，花药在消毒前，应先进行预处理，将花蕾剪下放入水中，在冰箱为4-5下保持3-4d，低温贮藏后，进行花药的灭菌消毒。花药的灭菌消毒：j选取所需的一种或几种消毒剂，如70%乙醇、1%次氯酸钠、0.5%新洁尔灭，备好待用；k去除花萼，滴入少许洗洁精，用自来水冲洗2-4h；在无菌条件下，用70%乙醇表面消毒30s后，再用不同消毒剂继续消毒；用无菌水清洗4-5次；无菌滤纸吸干花蕾表面水分后，剥掉花瓣取下花药，立即接种于无菌培养基上，一个10mL的试管接种20个花药；在25的培养箱中进行暗培养；每隔3-5d观察记录一次，直到结果不再变

37、化为止。(3) 接种：在无菌条件下，将花药从花蕾中取出并及时接种到培养基上。取花药时，应注意：j尽量避免损伤花药（否则接种后易从受伤部分产生愈伤组织或胚状体）k彻底去除花丝部分（否则不利于花药内小孢子的启动及愈伤组织或胚状体的形成）(4) 培养基的选择与灭菌a. 培养基的选择：花药培养所常用的培养基为MS、B5、Nitsch、N6等，培养基的种类因植物种类不同而不同，附加成分主要为蔗糖和激素（主要是生长素类(2,4-D、NAA、IAA、IBA等)和细胞分裂素类(6-BA、KT、ZT)）。b. 培养基的灭菌：常规采用高压蒸汽灭菌锅灭菌，121，灭菌15-20min。(5) 培养方式和培养条件a.

38、 培养方式：j在琼脂固化培养基表面培养k在加入30%聚蔗糖（Ficoll)的液体培养基表面漂浮培养利用液-固双层培养基培养b. 培养条件：u温度：早期的工作多在25-28下进行培养，最初先在较高温度培养更好。 v光照：愈伤组织的分化原则上都应在光照条件下进行，但对光照温度和光照 时间的要求则因物种而异。(6) 再生单倍体植株：通过花药培养诱导单倍体植株再生模式有两种途径：j经胚状体的再生途径k经过愈伤组织、器官分化的再生途径。两条途径并不是完全独立的，许多植物可通过改变培养基种类及其添加成分而改变单倍体的诱导形成途径或使两种途径并存。4、 花粉培养：是指当花粉发育到一定阶段，从花药中分离出单个

39、花粉粒，为获得单倍体植株接种到特定培养基上，诱导其长出愈伤组织，再将愈伤组织移植到另一种特定的培养基上，诱导分化出根、茎、叶，成为完整植株的培养途径。（是指将离体的花粉粒接种到培养基上，诱导形成单倍体再生植株的技术。）细胞培养范畴5、 花粉培养的方法(1) 花粉的分离：j机械分离法k散落花粉法挤压法(2) 花粉的预处理：a. 低温处理：取花粉处于适合发育期的花蕾，放在冰箱里4-10，进行1-15d的低温处理，再转移到25条件下培养。b. 高温处理：先用较高温度（32）培养游离小孢子3d后，再于25下进行正常的培养（芸薹属植物的花粉）。c. 药剂预处理：u甘露醇预处理v乙烯利处理w高糖浓度预处理

40、x秋水仙素预处理d. 离心预处理：在花粉培养中，在从花蕾取出花药前1h，5条件下进行低温离心。e. 其它预处理：射线照射、磁场处理单核期的花蕾。(3) 培养基：一般选用Nitsch作为基本培养基，其中含有硝酸钙、硫酸、柠檬酸铁、酵母浸出液和椰乳等。(4) 花粉培养途径:a.浅层液体培养途径 b.看护培养途径 c.微室培养途径(5) 再生小植株的驯化和移植花粉和花药培养均可产生再生单倍体植株，但花粉培养是通过胚状体阶段分化发育为单倍体植株；而花药在诱导培养基上，先形成愈伤组织，再诱导分化成植株。花药培养获得的再生植株可能是花粉发育再生的单倍体也可能是来源于花药壁、绒毡层等的体细胞再生的二倍体。要

41、顺利通过这一关需采用逐步过渡的方式，使其适应从易养到自养。j苗驯化：恢复叶绿体功能，各类试管苗的驯化期因植物种类的不同而不同。k培养基冲洗干净，防止微生物侵染。从培养基到土壤，注意营养土配方的筛选。移植后保持高的空气湿度和低的土壤湿度。6、 花药培养和花粉培养的不同点：（1）培养概念不同：花药培养是指用植物组织培养技术，将花粉发育到一定阶段的完整花药，通过无菌操作技术，接种到人工培养基上，诱导形成单倍体再生植株；花粉培养是指将离体的花粉粒接种到培养基上，诱导形成单倍体再生植株的技术。花粉培养不受花药的药壁、药隔、花丝等体细胞的干扰。（2） 培养层次不同：花药培养属于器官培养范畴；花粉培养属于细

42、胞培养范畴。（3）培养过程不同：花药培养相对较容易，技术比较成熟，但最后需要对培养成的植株进行染色体倍数检测；花粉培养虽没有药壁等二倍体细胞干扰，但技术更复杂，难度较大。7、染色体加倍的方法：适宜浓度的秋水仙素P114第6章 植物胚胎培养1、 植物胚胎培养：指采用人工方法把胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌条件下，让其进一步生长发育，一直形成幼苗的过程。（包括成熟胚培养、幼胚培养，广义还包括子房培养、胚乳培养、离体授粉等技术）(1)培养对象：成熟胚、幼胚、胚珠、子房2、 胚胎培养的意义：j克服远缘杂交不亲和性和幼胚败育k打破种子休眠、提高种子萌发率、缩短育种周期成熟胚培养快速繁殖通过胚

43、胎培养筛选转基因受体材料诱导胚性愈伤组织。3、 离体胚培养的发育途径：a. 按正常胚胎发育途径形成植株u成熟胚：正常发育形成小苗。v未成熟胚：维持胚的生长，进行正常的胚胎发育成熟，完成胚胎发育的全过程。b.脱分化形成愈伤组织 c.胚“早熟萌发”4、 胚胎培养的方法植物胚胎培养可分为成熟胚培养和幼胚培养。(1) 成熟胚培养：将子叶期以后的胚从母体上分离出来 ，放在无菌的人工环境条件下使其进一步生长发育形成幼苗的技术。一般指子叶期至发育成熟的胚的培养，属于自养型，只需极简单的含无机盐和糖的培养基。(2) 幼胚培养：将子叶期以前的具胚结构的幼小胚从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下使其进一步生

44、长发育形成幼苗的技术。指胚龄处于原胚期、球形胚、心型期、鱼雷型的培养，属于异养性，培养基成分复杂。a. 培养方法：远缘杂交幼胚培养杂交取材 消毒 剥取幼胚及接种 培养 驯化移栽与染色体加倍b. 幼胚培养的生长方式：u胚胎发育：幼胚接种到培养基上后，仍按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟的胚，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株。v早熟发育：幼胚接种，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，在大多数情况下，一个幼苗萌发成一个植株。w多数植物幼胚形成愈伤组织，再分化成胚状体或形成芽苗，最后形成植株。一般由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种易分化形成植株。5、胚珠培养：指在人工

45、控制的条件下，对胚珠进行离体培养使其生长发育形成幼苗的技术。(1)种类：a.受精胚珠培养 b.未受精胚珠培养：为试管受精提供雌配子体。6、胚乳培养：指将胚乳组织从母体上分离出来，提供离体培养技术，使其发育成完整植株的技术。(1)离体胚乳的发育及其植株的形成过程：j愈伤组织的诱导k愈伤组织的再分化胚乳苗的生根培养7、 子房培养：指将子房从母体植株上摘下，放在无菌的人工环境条件下，使其进一步生长发育形成幼苗的技术。(1) 种类：a. 授粉前子房培养：为了获得孤雌生殖的单倍体植株，适用于那些胚囊分离特别困难的植物。b. 授粉后子房培养：适用于那些获得种子特别困难，胚分离不易操作的植物，以获得种子或果

46、实或植株。8、 离体受精：也称试管受精，是指将雌蕊、子房或胚珠置于无菌条件下离体培养，在适宜时机进行人工授粉，使其受精形成具有生活力的种子。(1) 意义：可应用于育种工作中克服自交不亲和性和杂交不亲和性，特别是克服花粉在柱头上不萌发或萌发后不能进入花柱，或在花柱中生长缓慢，使配子不能如期融合方面有着极其重要的意义。(2) 方法：a. 子房试管受粉:j直接引入法k注射法b. 胚珠试管受粉:哺育法柱头接近法c.人工分离卵细胞、精子：真正意义上的离体受精第7章 植物细胞培养与次级代谢产物生产1. 植物细胞培养：指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术。(1) 分类：a. 根据研

47、究目的不同分为：诱变培养、次级代谢产物生产培养、突变体筛选培养。b. 根据培养规模不同分为：小规模培养、大批量培养。c. 根据培养方式不同分为：悬浮培养、平板培养、看护培养、饲喂细胞层培养。2. 细胞培养首先需要分离单细胞，用于细胞培养的细胞来源主要有两个：j植物的组织或器官k离体培养产生的愈伤组织（1） 由植物组织或器官分离单细胞(1) 分离方法：a.机械法 b.酶解法由完整的植物器官分离单细胞，叶片是分离单细胞的最好材料。a. 机械法：适用于薄壁组织排列松散，细胞间接触点很少的情况。法1 用刀片刮叶片：撕去下表皮，露出叶肉细胞，用解剖刀刮下细胞，直接接种于液体培养基进行培养，获得单细胞。法

48、2 叶片研碎、离心：选取无菌或经过消毒的叶片、嫩茎等，将其剪碎并研磨成匀浆，通过过滤和离心再接种于液体培养基中（或将研碎的组织先进行悬浮培养，再对悬浮培养物进行过滤和离心处理，去除其中的杂质和较大的细胞团），获得单细胞。b. 酶解法：果胶酶优点缺点机械法j避免细胞受到酶的伤害k细胞无需质壁分离只适用于薄壁组织排列松散，细胞间的接触点很少的情况酶解法j应用广 k效率高j所用的酶会对细胞造成一定的伤害k容易引起细胞质壁分离（2） 由离体培养产生的愈伤组织分离单细胞(1) 步骤：先诱导产生愈伤组织；将其反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；将愈伤组织在液体培养基中培养，并置于摇床上进行振荡

49、培养，建立悬浮培养物。(2) 注意:a. 选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。b.选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度，特别是生长素，必要的附加物质，例如水解酪 蛋白、Pro、Gln。c.多次继代的目的：使愈伤组织不断增殖，扩大其数量，并获得均匀一致疏松的愈伤组织。3.细胞悬浮培养：是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。(1) 特点：j细胞可以不断增殖，形成高密度 的细胞群体，适于大规模培养。k能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。(2) 应用：j人工种子k次级代谢产物生产离体的原生质体突变种筛选植物体(3) 培养基：对于用

50、愈伤组织制备的悬浮细胞培养的培养基以原愈伤组织继代时的培养基除去琼脂为好。为了提高细胞的分散度，对于生长素和细胞分裂素的比例需要进行一些调节。常用于细胞悬浮培养的培养基有：MS、B5、ER。(在细胞的起始培养密度约为5*104个/mL或更高时才适用。)当细胞密度较低时，在培养基中还需补加其他成分，使培养基组成更丰富，才能用于细胞的培养。因为培养基成分和起始细胞密度是决定细胞培养成败的关键，起始细胞密度越高，越容易诱导细胞发生分裂，对培养基成分的要求越宽松。(4) 最低有效密度：在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细胞能够增殖的最少接种量。因培养材料、原种培养条件，原种保存时间长短、培养基的成分不同而有

51、差异，一般为104105细胞/ml。(5) 活细胞测定： 活细胞率（%）=（5个视野中的活细胞数/5个视野中的细胞总数）*100%测定方法：j醋酸酯荧光素（FDA）染色法：在荧光显微镜下观察，可看到活细胞发红色荧光，死细胞和破损细胞则无。 FDA既不发荧光也不具极性，可自由进出细胞，在活细胞内被酯酶裂解并能释放出荧光素，由于荧光素不能自由穿越质膜，因而在完整的活细胞内积累。k酚藏红花染色法：在光学显微镜下观察，染成红色的是死细胞，无色的是活细胞。(6) 在分批培养中，细胞数目增长变化情况表现为一条“S”形曲线，其生长周期为延滞期、对数生长期、稳定期、衰亡期。(延滞期、对数生长期、直线生长期、减

52、慢期、静止期)(7) 细胞生长量的测定方法：j细胞计数k细胞密实体积细胞鲜重和干重细胞有丝分裂指数的测定细胞计数：一般用血球计数板进行，先用铬酸或果胶酶对细胞和细胞团进行处理，使其分散。(8) 细胞的同步化：指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。（指在培养中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段(G1、S、G2和M)）P143一般情况下，悬浮培养细胞都是不同步的，为取得一定程度的同步化，常用的处理方法有：a. 物理法：j分选法(滤膜过滤)k冷处理法b. 化学法：j饥饿法（断绝供应一种细胞分裂所必须的营养成分或激素） k抑制剂法（DNA合成抑制剂，羟基脲） 有丝分裂阻抑

53、（秋水仙素） 在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。用于处理 的细胞系最好处于对数生长期。4、 单细胞培养技术(1) 植物细胞培养，按培养细胞数量的多少分为：单细胞培养、多细胞悬浮培养。按培养方法分为：悬浮培养、平板培养、看护培养、微室培养、液体浅层培养等。(2) 植物单细胞培养的意义：j建立单细胞无性系k排除体细胞的干扰利于对细胞活动跟踪观察。(3) 单细胞培养方法：a.平板培养：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度与一定量的琼脂培养基均匀混合，并倒入培养皿使之形成一薄层进行培养的方法。植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺

54、与培养皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或parafilm封口膜将培养皿封严以防污染。在25黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。植板率()(每平板形成的细胞团数/每平板接种的细胞数)×100形成的细胞团数的计数法：j直接计数法k感光法（暗室的红光下）b.看护培养：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法c.微室培养：通过人工制造一个小室，将单细胞置于小室中的少量培养基上进行培养，使其分裂增殖形成细胞团的方法。(如使用带凹穴的载玻片并加盖玻片构建微室)d.液体浅层培养：将含有单细胞的悬浮培养液置于一定培养器皿中，并使之在底部形成一薄层的静止液体的培养方法。（浅层厚度以1mm为宜，最后用石蜡膜封闭器皿开口，置垫有湿滤纸的封闭容器内进行培养）e.其他单细胞培养技术：j饲养层培养基技术k双层滤纸植板培养方法(饲喂细胞层法和条件培养法)条件培养基：将细胞以最适的培养密度在液体培养基中培养一段时间，然后将培养液中的悬浮细胞去除，保留下来培养液与一定量的新培育基混合，制得的培养基即为条件培养基。5.培养植物细胞生产有用物质的意义：j有些植