实验六吲哚乙酸氧化酶活的测定ppt课件

1、南京师范大学 生命科学学院一，实验目的与要求一，实验目的与要求 了解吲哚乙酸氧化酶的生理功能和了解吲哚乙酸氧化酶的生理功能和分布；分布； 掌握测定植物体吲哚乙酸氧化酶活掌握测定植物体吲哚乙酸氧化酶活性的方法。性的方法。二，实验资料与试剂二，实验资料与试剂1，资料 绿豆幼苗的下胚轴。2，试剂20mmol/L的磷酸缓冲液pH6.0)；1mmol/L的2、4-二氯酚；1mmol/L的氯化锰；200ug/mL 的吲哚乙酸少量乙醇溶解后定容；试剂B：0.5mol/LFeCl3-35%过氯酸(V:V=1:50)， (运用前混合，避光保管。三、实验原理三、实验原理1、知识背景 知识背景：植物的生长物质知识背

2、景：植物的生长物质 定义：调理植物生长发育的物质。 分类： 1、植物激素plant hormone 在植物体内合成、并从产生处运送到别处，对发育产生显著作用的微量有机物； 2、一些具有植物激素活性的人工合成物质。五大类激素的生理功能五大类激素的生理功能种种 类类主要生理作用主要生理作用生长素生长、生长、 促进生根、发芽促进生根、发芽赤霉素细胞伸长、促进种子萌发、细胞伸长、促进种子萌发、果实成熟果实成熟细胞分裂素细胞分裂细胞分裂脱落酸细胞分裂、促进叶、果实衰细胞分裂、促进叶、果实衰老脱落老脱落乙 烯果实的成熟果实的成熟五大类激素的产生部位五大类激素的产生部位种种 类类主要合成部位主要合成部位生长

3、素主要在主要在赤霉素未成熟的种子、幼根、幼芽未成熟的种子、幼根、幼芽细胞分裂素主要是根尖主要是根尖脱落酸根冠、萎蔫的叶片等根冠、萎蔫的叶片等乙 烯植物体各个部位。植物体各个部位。生长素是什么19341934年提取：年提取：吲哚乙酸吲哚乙酸IAAIAA苯乙酸苯乙酸PAAPAA吲哚丁酸吲哚丁酸IBAIBA具有生长素效应的还有：具有生长素效应的还有：生长素的发现生长素的发现Darwin的向光性实验Darwin的向光性实验达尔文的推测：达尔文的推测： 单侧光照射使胚芽鞘的尖端产生某单侧光照射使胚芽鞘的尖端产生某种刺激，当这种刺激传送到下部的伸长种刺激，当这种刺激传送到下部的伸长区时，会呵斥背光面比向光

4、面生长快，区时，会呵斥背光面比向光面生长快，因此出现向光性弯曲。因此出现向光性弯曲。詹森的实验1910和拜尔的实验1914詹森实验证明：詹森实验证明： 胚芽鞘尖端产生的刺激胚芽鞘尖端产生的刺激物可以透过琼脂片。物可以透过琼脂片。拜尔实验证明：拜尔实验证明： 弯曲生长是由于顶尖产弯曲生长是由于顶尖产生的刺激物分布不均匀生的刺激物分布不均匀呵斥的。呵斥的。F.W.Went的实验实验结论总结实验结论总结生长素的产生部位：生长素的产生部位：生长素的作用部位生长素的作用部位胚芽鞘的生长部位胚芽鞘的生长部位胚芽鞘的感光部位：胚芽鞘的感光部位：胚芽鞘的尖端胚芽鞘的尖端胚芽鞘的尖端下段胚芽鞘的尖端下段胚芽鞘的

5、尖端胚芽鞘的尖端结论：结论： 胚芽鞘顶端能产生化学物质，向下传输到去顶胚芽鞘，并影响后者的生长； Went称这种化学物质为生长素 ； 1934年初次提取纯化出刺激生长的物质，经鉴定为吲哚乙酸IAA。生长素为什么能引起向光弯曲？生长素为什么能引起向光弯曲？生长素的产生部位生长素的产生部位生长素的分布生长素的分布生长素的运输方向生长素的运输方向主要在幼嫩的芽、叶、主要在幼嫩的芽、叶、发育的种子。发育的种子。大多集中在生长旺大多集中在生长旺盛的部位。盛的部位。从植物体形状学上端从植物体形状学上端向形状学下端运输向形状学下端运输 。根：背向根尖运输根：背向根尖运输茎：背向茎尖运输茎：背向茎尖运输生长素

6、的分布与运输生长素的分布与运输010-1010-810-610-410-2c/molL-1促促进进生生长长抑抑制制生生长长根根芽芽茎茎对生长素的敏感度：对生长素的敏感度：A生长素的生理作用和最适浓度生长素的生理作用和最适浓度生长素浓度的调理方式：生长素浓度的调理方式：生长素的结合： 束缚生长素 自在生长素与糖、氨基酸等结合合成、降解、运输、结合、区域化生长素的降解：1光氧化；2酶促降解脱羧降解吲哚乙酸氧化酶IAA oxidase不脱羧降解2、综上所述、综上所述 吲哚乙酸氧化酶能调理植物体内IAA的程度，从而影响植物的生长。 生长素分布在生长旺盛的部位，IAA氧化酶分布在生长不旺盛的部位。 酶活

7、力的大小可以用破坏IAA的速率表示，即： IAA氧化酶活力 = IAA减少的速率3、实验设计、实验设计 在无机酸存在下，IAA能与FeCl3作用，生成红色的螯合物。该物质在530nm处有最大光吸收峰。留意：假设待测物与另一底物反响后 1，生成稳定的产物； 2，产物有特定的光吸收峰。三，实验步骤三，实验步骤1，提取IAA氧化酶 称取0.5g绿豆下胚轴，分次参与预冷的磷酸缓冲液pH6.05mL，冰浴研磨，4000rpm离心20分钟，取上清液，即为粗酶液。试管号试管号MnCl22、4-二氯酚二氯酚IAA(200ug/mL)酶液酶液磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH6.0)实验1mL1mL2 mL1 mL5m

8、L对照1mL1mL2 mL6mL两管分别混匀，两管分别混匀，25 25 水浴保温水浴保温30min30min。2，IAA氧化酶与氧化酶与IAA的反响的反响3，测定，测定IAA氧化酶活性氧化酶活性 混合试剂B： 0.5mol/LFeCl3+35%过氯酸(V:V=1:50) 30min后另取2支试管，每支参与试剂B 4mL，再按表参与反响液orIAA的梯度浓度溶液各2mL 。试管试管实验实验对照对照反应液反应液 （各）（各）实验溶液实验溶液 2mL对照溶液对照溶液 2mL2支试管于40 下保温30min，使反响液呈红色。530nm处测OD值，分别记为OD实验、OD对照。4.制造规范曲线制造规范曲线

9、试管试管0123456IAA梯度液梯度液0ug/ml2ug/mL5ug/mL10ug/mL15ug/mL20ug/mL25ug/mL另取另取7支试管，每支参与试剂支试管，每支参与试剂B 2mL，再按表参，再按表参与与IAA的梯度浓度溶液各的梯度浓度溶液各1mL 。以以0管溶液调零，分别测定管溶液调零，分别测定530nm处吸光值。处吸光值。同时，配制IAA梯度浓度溶液各10mL5、结果计算、结果计算 以06管的IAA浓度为横坐标，以相应的OD值为纵坐标，绘制规范曲线。 根据实验、对看管的OD值，在规范曲线上查出相应的IAA浓度。 IAA氧化酶活性 ugIAA/g FW.h) (C对照-C实验)*VT*V=W.t.V1VT：酶液总体