PikoReal使用培训致病菌检测实用教案

1、内容：1、荧光定量PCR基本原理介绍2、PikoReal 功能简介3、致病菌检测实验(shyn)操作及结果分析第1页/共65页第一页，共66页。 PCR和定量和定量(dngling)PCR 基本知识介绍基本知识介绍第2页/共65页第二页，共66页。生命的遗传物质DNA（少数物种为RNA），对于不同的物种来说，其碱基排列(pili)顺序是独一无二的检测不同生物中特异的DNA片段，就可以清楚的区分不同的生物。第3页/共65页第三页，共66页。中心法则中心法则(zhn xn f z)碱基配对碱基配对(jin j pi du)原则原则第4页/共65页第四页，共66页。Polymerase Chain

2、Reaction（PCR） 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(lin sh fn yng) 体外的体外的DNA 复制复制(fzh) PCR 反应反应体外体外RNA 逆转录为逆转录为CDNA RT- PCR 反应反应通过PCR或RT-PCR反应，就可累计大量的特异性目的片段(pin dun)，用于下游的检测和研究第5页/共65页第五页，共66页。Melting 94CPrimers Bind 58CExtension 72CPCR的基本原理的基本原理第6页/共65页第六页，共66页。PCR的基本原理的基本原理Polymerase Chain Reaction（PCR） 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(

3、lin sh fn yng) 第7页/共65页第七页，共66页。 在PCR反应过程中，升温，降温交替进行，循环往复(xn hun wng f) 热循环 提供热循环环境的仪器 热循环仪（PCR仪）TemperatureTimeMeltAnnealCopyMeltAnnealCopyCycle 1Cycle 2PCR的基本原理的基本原理第8页/共65页第八页，共66页。 模板（DNA or RNA） DNA：从 animal, plant, bacteria, yeast, virus中抽提 RNA：抽提后逆转录为cDNA(也在PCR仪上完成） 引物（一对或多对） 脱氧核糖核苷酸 (dNTP原料)

4、 热稳定的DNA聚合酶 Buffer （缓冲液提供适合的酶作用(zuyng)环境） 反应体系：5 - 50ul （常用）PCR的基本原理的基本原理PCR 反应反应(fnyng)体系体系PCR kit第9页/共65页第九页，共66页。PCR的基本原理的基本原理PCR实验实验(shyn)流程图流程图: A模板模板(mbn)，引物，引物,dNTP, 缓冲液缓冲液,DNA聚聚合酶合酶上样PCR反应反应(fnyng)第10页/共65页第十页，共66页。PCR的基本原理的基本原理PCR实验实验(shyn)流程图流程图: B+-PCR产物(chnw)电泳，EB染色第11页/共65页第十一页，共66页。两种产

5、物(chnw)两对特定(tdng)引物扩增的片段多种产物(chnw)非特异性引物扩增出一系列片段PCR实验流程图实验流程图: CPCR的基本原理的基本原理凝胶成像系统成像，定终产物浓度 半定量第12页/共65页第十二页，共66页。 PCR是当今应用最广泛的生物(shngw)技术之一 几乎所有的分子生物(shngw)学实验室，药物研发中心，临床诊断实验室都在使用PCR技术，而且还有新的应用方向不断开发出来 几个重要的应用领域: 科学研究 医学研究及诊断 法医鉴定 食品检验PCR应用应用(yngyng)第13页/共65页第十三页，共66页。 PCR技术技术(jsh)的优点与缺点的优点与缺点缺点：扩

6、增与检测分开进行 繁琐使用荧光(ynggung)染料EB检测DNA 有毒不同实验室之间结果没有可比性通量太低扩增检测(jin c)第14页/共65页第十四页，共66页。 PCR技术技术(jsh)的优点与缺点的优点与缺点缺点：缺点：很难准确得到很难准确得到(d do)样本内模板样本内模板DNA或或RNA的量的量终点的产物量不一定能如实反应和起始模板量的对应关系终点的产物量不一定能如实反应和起始模板量的对应关系相同模板在同一台PCR仪上相同条件(tiojin)下重复96次扩增的扩增曲线图PCR反应进入平台期，合成新链的原料开始不足，酶的活力也下降，导致新增DNA的量增长缓慢，最后停止增长。第15页

7、/共65页第十五页，共66页。荧光荧光(ynggung)定量定量PCR 基本原理基本原理 荧光荧光(ynggung)染料和探染料和探针针 应用介绍应用介绍第16页/共65页第十六页，共66页。光源光源(gungyun)荧光荧光(ynggung)定量定量PCR 基本原理基本原理热循环仪热循环仪探测器探测器可以实时检测出每轮循环(xnhun)的PCR产物量加入荧光染料的PCR体系模板，引物模板，引物,dNTP, 缓冲缓冲液液,DNA聚合酶和聚合酶和荧光荧光探针或荧光染料探针或荧光染料第17页/共65页第十七页，共66页。在体系中原料充足的情况(qngkung)下，产物按固定倍数呈指数增长指数增长期

8、间，初始模板浓度不同的样品的扩增曲线彼此平行同时(tngsh)扩增梯度稀释的同一样品（已知浓度）扩增曲线(qxin)循环数与初始模板浓度的对数值成线性关系Cq荧光定量荧光定量PCR 基本原理基本原理未知浓度样品未知浓度样品Cq = - k lg X0 + b 标准曲线：标准曲线：第18页/共65页第十八页，共66页。区别：普通PCR：可以粗略定出反应(fnyng)结束时终产物的量- 半定量荧光定量PCR仪：可以精确测量出初始模板量第19页/共65页第十九页，共66页。荧光荧光(ynggung)定量定量PCR 荧光荧光(ynggung)染料和探针染料和探针 非特异性的荧光染料非特异性的荧光染料(

9、rnlio)(rnlio) SYBR Green I SYBR Green I 特异性的荧光探针特异性的荧光探针 TaqMan TaqMan 第20页/共65页第二十页，共66页。5353SGExcitationSGSGSGSGEmission第21页/共65页第二十一页，共66页。5353SGSGSGSGSGExcitationEmission第22页/共65页第二十二页，共66页。融解融解(rngji)(rngji)曲线分析（曲线分析（TmTm）Tm：50%的DNA产物解链时的温度一种DNA片段只有一个特定(tdng)的Tm，所以通过溶解曲线分析，可以检验扩增的产物是否是目的片段Tm第23

10、页/共65页第二十三页，共66页。应用(yngyng)列举：酵母菌检测根据(gnj)Tm值判断是否是酵母菌第24页/共65页第二十四页，共66页。RQSequence Specific Probes:Taqman probes53535353ExcitationRQ QRQRExcitation第25页/共65页第二十五页，共66页。常用(chn yn)的标记探针的染料：第一通道：FAM第二通道：HEX第三通道：Rox第四通道：CY5第26页/共65页第二十六页，共66页。致病微生物：致病微生物：沙门氏菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌单核细胞增生李斯特氏杆菌单核细胞增生李斯特氏杆菌 肠毒

11、素大肠杆菌肠毒素大肠杆菌阪崎肠杆菌阪崎肠杆菌弯曲杆菌（禽类）弯曲杆菌（禽类）肉毒梭菌肉毒梭菌志贺氏菌志贺氏菌小肠结肠炎耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌霍乱弧菌(h jn)副溶血弧菌副溶血弧菌(h jn)创伤弧菌创伤弧菌(h jn)等等均能把均能把3-5天的检测时间缩短到一天之内天的检测时间缩短到一天之内第27页/共65页第二十七页，共66页。单重和多重荧光定量PCR单通道（单色）：一个PCR管里只做一个基因定量（多用SybrGreen）双通道（两色）：一个PCR管里做两个(lin )基因的定量多通道（多色）：一个PCR管里做三个以上基因定量常用(chn yn)FAMHEX第28页/共65

12、页第二十八页，共66页。PikoReal 功能功能(gngnng)简介简介第29页/共65页第二十九页，共66页。研发(yn f)生产中心：位于芬兰Espoo第30页/共65页第三十页，共66页。 光源光源: 5x LED 寿命长，终身无需更换，为寿命长，终身无需更换，为qPCR实验提供持续，稳定的激发信号实验提供持续，稳定的激发信号 无需使用无需使用ROX染料染料(rnlio)进行光强校正进行光强校正 探测器：探测器：CCD 相机相机 能同时快速收集整板多重荧光信号数据能同时快速收集整板多重荧光信号数据 高灵敏度高灵敏度 PCR模块：模块：96孔半导体孔半导体PCRPikoREAL 的硬件的

13、硬件(yn jin)系统系统:第31页/共65页第三十一页，共66页。功能功能(gngnng)：绝对绝对(judu)定量定量双探针双探针(tn zhn)法法HRM法法相对定量相对定量基因型分析基因型分析熔解曲线分析熔解曲线分析选配模块第32页/共65页第三十二页，共66页。五通道五通道(tngdo)四色：四色：激发波长激发波长 (nm)发射波长发射波长 (nm)预校正的染料预校正的染料475500520550FAM, SYBR Green515535557590HEX, Yakima Yellow570590615650ROX, Texas Red600640666740Cy 54755005

14、20590单色通道，单色通道，HRM通道通道一个反应管里最多可同时检测(jin c)4种不同的致病菌核酸第33页/共65页第三十三页，共66页。仪器特点：仪器特点：1、硬件组合优越，设计创新、硬件组合优越，设计创新2、更加适合、更加适合(shh)5-10ul小反应体系，成倍节省实验成本小反应体系，成倍节省实验成本3、小巧、快速、稳定、安静无声、小巧、快速、稳定、安静无声第34页/共65页第三十四页，共66页。 致病菌检测实验操作及结果致病菌检测实验操作及结果(ji gu)分析分析第35页/共65页第三十五页，共66页。检测检测(jin c)流程流程25g 或25ml 样品 225ml预增菌培养

15、(piyng)液，混匀 ，适宜的温度下培养(piyng)24小时取1ml培养液，加入裂解液，裂解细菌(xjn)，释放核酸（45min）配制标准品，PCR反应液，加样（30min）定量PCR反应，查看并分析结果（）阴性：出结果报告阳性：继续用培养法验证结果两天内可出结果第36页/共65页第三十六页，共66页。检测项目检测项目 GBGB中的名称中的名称OXOID的英文名称的英文名称OXOID的中文名称的中文名称 OXOID货号货号规格规格沙门氏菌 缓冲蛋白胨水（BPW）Buffer Peptone Water(ISO)缓冲蛋白胨水(ISO)CM1049B500gCM1049R2.5kgCM1049

16、T5kg金葡菌10%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤Tryptone Soya Broth（SoybeanCasein Digest M edium USP）胰蛋白胨大豆肉汤（美国药典中大豆酪蛋白消化物培养基）CM0129B500gCM0129R2.5kgCM0129T5kg大肠埃希氏菌O157：H7/NM 改良EC肉汤EC BROTH (Reduced Bile Salts) EC肉汤（减少胆盐） CM0990B500g志贺氏菌 GN增菌液GN Broth GN增菌液R453511100 gR453512500 gR4535142.5 kgOXOID 常用(chn yn)预增菌培养液：赛默飞咨询(zx

17、n)热线：80081051181、预增菌 按说明书操作(cozu)第37页/共65页第三十七页，共66页。2、细菌裂解，配制、细菌裂解，配制(pizh)反应液及上样反应液及上样1）细菌裂解：获得待测样品。2）配制标准品：阴性对照样品，阳性(yngxng)对照样品（4个浓度）3）按检测样品量计算所需反应液的量4）配制所需反应液，混合均匀5）把反应液加入反应板，并分别在相应的孔加入阴性对照样品、阳性(yngxng)对照样品，待测样品。以下操作均按照(nzho)检测试剂盒操作说明书进行：第38页/共65页第三十八页，共66页。检测试剂开放(kifng)，可选择各国产及进口厂家试剂盒第39页/共65页

18、第三十九页，共66页。 以金黄色葡萄球菌以金黄色葡萄球菌(p to qi jn)的检测为例的检测为例1、样品预增菌25g 或 25ml 样品 10%氯化钠胰蛋白(dnbi)胨大豆肉汤37度，24小时金黄色葡萄球菌：Staphylococcus Aureus (SA) 第40页/共65页第四十页，共66页。 以金黄色葡萄球菌以金黄色葡萄球菌(p to qi jn)的检测为例的检测为例2、细菌裂解，样品制备A、取1ml 培养液，13000rpm 离心(lxn)2分钟B、去上清液，加入100ul DNA提取液充分混匀C、沸水浴加热10分钟（误差不超过1分钟）D、13000rmp 离心(lxn)5分钟

19、，上清液备用（样品）试剂盒：Liferiver 金黄色葡萄球菌核酸(h sun)检测试剂盒（荧光法）生产商：上海之江生物科技 货号：DD004102第41页/共65页第四十一页，共66页。3、梯度标准品配制A、内部对照：取内部对照品4ul，加36ul水，震荡混匀后，3000rmp离心10秒，备用。B、10倍稀释标准品（如只需出阴阳性结果(ji gu)，则无需配制系列浓度的阳性标准品）1）取4只2ml离心管，分别标记为：2、3、4、5 （浓度依次为：5106 、 5105 、 5104 、 5103 拷贝/ml) 。2）各管中分别加入36ul水3）取4ul 阳性对照品加入1号管中，震荡混匀后取4

20、ul加入2号管，2号管震荡混匀后取4ul加入3号管。依此处理4号管。第42页/共65页第四十二页，共66页。4、反应液配制1（绝对定量法用)计算所需各反应液成分，按下表量加入2ml离心管，震荡混合均匀绝对定量标准(biozhn)品 ：5 (5个浓度，可定量出未知样品拷贝数）阴性对照：1未知样品：n （n为未知样品数）成分成分需要量（需要量（ul）SA 核酸荧光PCR检测反应液（6n） 17.5ul 110酶（Taq UNG）（6n） 0.2ul 110内部对照（6n） 0.5ul 110 110 是指多配是指多配10，以补偿配制和加样过程中的损耗，以补偿配制和加样过程中的损耗(snho) 如每

21、个样品需要做如每个样品需要做2个或个或3个重复，则在各算式后再乘个重复，则在各算式后再乘2或或3即可即可第43页/共65页第四十三页，共66页。4、反应液配制1 (阴阳性判定法用)计算所需各反应液成分，按下表量加入2ml离心管，震荡混合均匀，3000rmp离心10秒，备用。绝对定量标准品 ：1 (1个浓度，作为(zuwi)阳性参照）阴性对照：1未知样品：n （n为未知样品数）成分成分需要量（需要量（ul）SA 核酸荧光PCR检测反应液（2n） 17.5ul 110酶（Taq UNG）（2n） 0.2ul 110内部对照（2n） 0.5ul 110 110 是指多配是指多配10，以补偿配制和加样

22、过程，以补偿配制和加样过程(guchng)中的损耗中的损耗 如每个样品需要做如每个样品需要做2个或个或3个重复，则在各算式后再乘个重复，则在各算式后再乘2或或3即可即可第44页/共65页第四十四页，共66页。5、上样A、取一片96孔Piko板，放入上样辅助仪，每孔加入反应液18ulB、取裂解的样品，加入un 孔，每种样品1孔；取稀释(xsh)号的标准品，依次加入最后一列的孔中。在0孔中加入2ul水。unununununununununununununununSunununununununununununununununSunununununununununununununununSununun

23、ununununununununununununSunununununununununununununununSununununununununununununununun0样品排列建议：S - 阳性标准(biozhn)品、0 阴性对照、un 未知样品 第45页/共65页第四十五页，共66页。6、覆膜，离心(lxn)，放入qPCR第46页/共65页第四十六页，共66页。 7、设置程序，点击、设置程序，点击Run启动启动(qdng)PCR反应反应编程双击桌面(zhumin)仪器图标，打开软件第47页/共65页第四十七页，共66页。2、点击New，新建一个运行文件(wnjin)，点击Protoco

24、l，进入程序编辑界面编程编程选中以上各步，选中以上各步，可以修改，添加可以修改，添加和删除和删除(shnch)反应步骤反应步骤点击反白不需要检测点击反白不需要检测的染料的染料(rnlio)，输，输入反应体系。入反应体系。第48页/共65页第四十八页，共66页。编程编程添加(tin ji)新循环添加溶解曲线(qxin)检测上下移动(ydng)或删除反应步骤输入或输出反应程序开始运行程序添加一个反应步骤添加数据采集步骤第49页/共65页第四十九页，共66页。编程编程参数(cnsh)修改左边选中要修改(xigi)的步骤，右边相应的框中修改(xigi)温度和时间如要修改(xigi)升降温速率，热盖温度

25、，点击“Advanced Properties”第50页/共65页第五十页，共66页。 点击点击Run启动启动(qdng)PCR反应反应第51页/共65页第五十一页，共66页。状态状态(zhungti)监控监控电脑电脑(dinno)监控监控随时可以(ky)点击HOME，回主界面编辑新程序，分析已有实验结果。或进入Plate Layout进行板式设置。第52页/共65页第五十二页，共66页。8、板布局、板布局(bj)点击Plate Layout，进入板布局(bj)界面，定位样品，输入名称，确定样品属性。- 程序运行前，运行中，运行结束均可进行设置和修改告诉软件各反应孔的样品(yngpn)信息第5

26、3页/共65页第五十三页，共66页。板布局板布局(bj)输入(shr)样品名称等信息样品(yngpn)分组孔信息拷贝，删除，粘贴，取消样品模块类型选择板布局输入，输出选择样品属性，分组，设重复，设标准曲线设置复孔第54页/共65页第五十四页，共66页。板布局板布局(bj)- 绝对定量绝对定量1、选择所用染料2、选择样品类型为Standard3、打开复孔和标准曲线设置向导4、输入复孔排列模式5、输入第一个样品浓度(nngd)（如1000000）6、从左到右拖拽选中所有标准品孔，标准曲线设置即可完成。7、未知样品孔的设置和命名同相对定量点击点击(din j)1234567第55页/共65页第五十五页，共66页。绝对定量 有梯度稀释(xsh)的标准品第56页/共65页第五十六页，共66页。阴阳性判定(pndng) 只有一个标准品第57页/共65页第五十七页，共66页。9、结果(ji gu)分析程序运行结束，Analysis 选项出现，