血红蛋白的提取与分离.PPT

1、12一、基础知识：一、基础知识： 凝胶色谱法：凝胶色谱法：P641、凝胶色谱法：也称、凝胶色谱法：也称分配色谱法是根据相对分配色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。32、凝胶色谱法的原理：、凝胶色谱法的原理：P64 在小球体内部有在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对质量不同的蛋白质通许多贯穿的通道，当相对质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对（过凝胶时，相对（ ）的蛋白质）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移），移动速度动速度 ，而（，而（ ）的）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在蛋白质无法进入凝胶内部的通

2、道，只能在（ ）移动，路程（）移动，路程（ ），移动），移动速度（速度（ ），相对分子质量不同的蛋白），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。质因此得以分离。分子质量较小分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快3、凝胶材料：、凝胶材料：一些微小多孔的球体一些微小多孔的球体（由多糖（由多糖类化合物构成的，如葡聚糖和琼脂糖）。类化合物构成的，如葡聚糖和琼脂糖）。P644洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。质分子的差速流动。混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子

3、流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢5 1、概念：、概念：能够抵制外界酸和碱对溶液能够抵制外界酸和碱对溶液PH的影响，维持的影响，维持PH值基本不变值基本不变的溶液，的溶液，叫做缓冲溶液。叫做缓冲溶液。 缓冲溶液：缓冲溶液：P6562、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 P65 通常由（通常由（ ）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得

4、（就可以制得（ ）使用的）使用的缓冲液。缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO37思考：思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？什么？它的目的是什么？使用的是使用的是磷酸缓冲液磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟，目的是利用缓冲液模拟生物体内的生物体内的PH环境，环境，保证血红蛋白的正常结保证血红蛋白的正常结构和功能。构和功能。82）原理：）原理：P66利用待分离样品中各种分子带电的差异以及分利用待分离样品

5、中各种分子带电的差异以及分子本身的大小、形状的使带电分子产生不同的子本身的大小、形状的使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。1）电泳：带电粒子在）电泳：带电粒子在电场电场的作用下发生的作用下发生迁移迁移的的过程。过程。思考思考：蛋白质为什么带有电荷？蛋白质为什么带有电荷？在一定的在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷下，蛋白质可解离的基团会带上电荷电泳：电泳：P6594）影响蛋白质分子运动速度的因素）影响蛋白质分子运动速度的因素3）分类：琼脂凝胶电泳；）分类：琼脂凝胶电泳；SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳（通常使用）胺凝胶电

6、泳（通常使用）p6610二二 、实验操作、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：P66（一）样品处理及粗分离（一）样品处理及粗分离 P66样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤P67采集血样。采集血样。低速短时间低速短时间离心（速度越高和离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果）不到分离的效果）用胶头吸管吸出上层透明用胶头吸管吸出上层透明的的黄色血浆。黄色血浆。下层暗红色下层暗红色的红细胞的红细胞生理盐水生理盐水洗涤。洗涤。低速短时间低速短时间离心

7、离心重复洗涤三次。重复洗涤三次。11、步骤（步骤（ ）次，直至上清液中已没）次，直至上清液中已没有（有（ ），表明洗涤干净。），表明洗涤干净。利于后续血红利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。三三黄黄色色12(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放 P67加（加（ ）到（）到（ ）体积）体积再加再加40体积的（体积的（ ）（）（ 溶解细胞膜溶解细胞膜） ，置于（置于（ ）上充分搅拌）上充分搅拌10分钟分钟（加速细胞破裂）（加速细胞破裂）细胞细胞破裂，释放出血红蛋白破裂，释放出血红蛋白.(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转将搅拌好混合液转

8、移到移到离心管离心管中中，以，以2000r/min的速度离心的速度离心10 min ，试管中的溶液分为，试管中的溶液分为4层层: p67原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水13第第1层（层（ ）甲苯层）甲苯层第第2层：（层：（ ）色薄层固体，脂溶性物质）色薄层固体，脂溶性物质第第3层：层：（ ）的水溶液层的水溶液层 （ ）的液体）的液体 第第4层：其它杂质（层：其它杂质（ ）的沉淀物）的沉淀物无色透明无色透明白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色14将试管中的液体将试管中的液体用用滤纸过滤。滤纸过滤。除去脂溶性沉淀层。除去脂溶性沉淀层。于分于分液漏斗中静置液漏斗中静置

9、片刻。片刻。分出下层的红色透分出下层的红色透明液体。明液体。15取取( )ml的血红蛋白溶液装入（的血红蛋白溶液装入（ ）中，）中，将透析袋放入盛有将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/L的（的（ ）中）中pH为为（ ），透析），透析12小时。小时。目的是目的是（ ）透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质透析袋透析袋磷酸缓冲液磷酸缓冲液7.0(4)粗分离：即透析。粗分离：即透析。 P6711617（二）凝胶色谱制作（二）凝胶色谱制作 P671、凝胶色谱柱的制作、凝胶色谱

10、柱的制作 （略讲）（略讲）取长取长40厘米，内径厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。端需用砂纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移安装移液管头部液管头部 覆盖尼龙网。覆盖尼龙网。（文字在（文字在67图在图在P68）18顶塞的制作：顶塞的制作：P68插入安装了玻璃管的插入安装了玻璃管的橡皮塞橡皮塞组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 P68192、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填 P68 （略讲）（略讲）（1）凝胶的选择：）凝胶的选择：选择选择交联葡聚糖交联葡聚糖凝胶凝胶（G-75） “G”

11、表示凝胶的交联程度，膨胀程度表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。及分离范围。 “75”表示凝胶的得水值，即每克凝胶表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水膨胀时吸水7.5克。克。（2）配置凝胶悬浮液：凝胶用蒸馏水充分溶）配置凝胶悬浮液：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，胀后，配成凝胶悬浮液。配成凝胶悬浮液。P68203、纯化：即样品加入与洗脱、纯化：即样品加入与洗脱 P68 加样前：加样前：打开下端出打开下端出口，使柱内凝胶面上的口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓冲液缓慢下降到与缓慢下降到与凝凝胶面胶面平齐，关闭出口。平齐，关闭出口。21加透析样品加透析样品 P68-69 用吸管小心地将用吸管小心地将1

12、ml透析后的样透析后的样品加到色谱柱的顶端。品加到色谱柱的顶端。22(三）、三）、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）（选做） P69判断（判断（ ）的蛋白质是否达到要求，需）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。在鉴定的方法中，使要进行蛋白质的鉴定。在鉴定的方法中，使用最多的是用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。纯化纯化23操作提示操作提示 P69 略略1、红细胞的洗涤。、红细胞的洗涤。2、色谱柱填料的处理。、色谱柱填料的处理。3、凝胶色谱柱的填装。、凝胶色谱柱的填装。4、蛋白质的分离。、蛋白质的分离。24观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品

13、离心后是否分层，是否分层，如果如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。（三）实验结果分析与评价三）实验结果分析与评价 P701.你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2.你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？谱柱装填得成功吗？你是如何判断