毕业论文少量猪细胞的快速性别鉴定

1、少量猪细胞的快速性别鉴定本科生毕业论文任务书论文题目少量猪细胞的快速性别鉴定学院名称指导教师毕业论文（设计）的内容摘要通过pcr扩增，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用pcr marker作分子量标 准，分别从雌性和雄性猪肌肉组织中扩增出不同的条带，从而达到性别鉴定的目 的通过pcr扩增哺乳动物雄性决定基因sry来鉴定胚胎的性别在畜牧业生产上已经 得到广泛应用，应用多重pcr同时扩增雌雄特界基因，使雌雄样品均有扩增产物. 本实验针对猪细胞设计了两对引物il31,2和gapdh-1,2。毕业论文（设计）基本要求及工作量要求1根据要求阅读相关文献10篇以上，翻译外文文献1篇以上，并对所查得的

2、资料进行深入分析整理，推敲试验的可行性，设计详细的实验方案。2.具体实验过 程中，着重培养动手操作以及独立思考问题与解决问题的能力。3.实验结束后要完 成一篇研究性论文，要求数据真实可靠，保持严格的客观真实性，结果讨论清晰 详细。4.学会word文档的编辑排版和幻灯片的制作。5.要求中文摘要不少于200 字，附有英文摘要，论文总字数在30005000字。毕业论文（设计）的主要阶段计划（分前期、中期、后期）前期:2013.3.12013.3.291、广泛查阅有关动物性别鉴定的文献。2、提出实验方案。3、做好材料、设备用具和方法的准备工作。中期:2013.3.302013.4.301、对传统基因组

3、dna提取进行优化改进。2、通过文献查阅对pcr反应的引物进行有针对性的设计。3、熟悉pcr仪的使用和琼脂糖凝胶电泳检测的全部过程，并熟练操作。4、进行猪细胞的快速性别鉴定。后期：2013.5.12013.5.91、进一步整理实验数据及图片。2、撰写和修改毕业论文并定稿、答辩。任务下发日期2013.3.1完成日期2013.5.9系主任：主管教学院长审批（签字）：少量猪细胞的快速性别鉴定摘要：本实验通过对雌雄成年猪肌肉组织所含因子的dna序列，设计了两对特 异性pcr引物，通过pcr扩增，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用pcr marker作分子量标准，分别从雄性和雌性组织中扩增出不同的条

4、带，从而达到 性别鉴定的目的。具有较高的应用价值。关键词：猪细胞，细胞培养；pcr法；性别鉴定pcr method of gender identification of cellsabstract： through the experiments of male and female mice hair (including hair follicle) contains the dna sequence of factor, the design of the two specific pcr primer, through the pcr amplification, amplifica

5、tion 1.5% agarose gel products in the electrophoresis, with pcr marker for molecular weight standard, separately from the male and female organization different channel expansion, so as to achieve the purpose of sex identification. it has higher application value.key words： mice, epithelial tissue；

6、pcr； gender identificationw s 1材料和方法-1-1.1 材料-1-1.2 方法-2-2试验结果-3-3讨论3. 1鉴定过程的高效性-4-3. 2 pcr鉴定的准确性-5-3.3注意事项-5-参考文献6致谢-6-随着科学技术的不断发展，我国畜牧业生产发生了翻天覆地的变化，性别 鉴定技术在畜牧业中的作用也日益明显。因为家畜的很多生产性状与性别 有关，如在乳制品生产中，需要较多的母畜；而在肉畜生产中，因雄性个体 的生长速度和产肉性能明显高于雌性个体而优先选择雄性；并且在消灭不理 想的隐性性状1乌达巴拉，赖双英，石泉。家畜早期胚胎性别鉴定技术的应用。畜 牧与饲料科学，20

7、05, (2)： 40 41,防止性连锁疾病2禹学礼，粟颖华。pcr在动物胚胎性别鉴定中的应用。洛阳农业高等专科学校学报。2002,22 ( 1 )： 27 28,加快遗传进展及 畜群的更新等方面也起重要作用。因此，如果能够有效地控制家畜的性别， 就能更好地利用自然资源，从而服务于人类自身。随着分子生物学的飞速发展 以及对畜禽生殖生理的深入研究，人们相继研发出了在实践中应用的性别鉴定方法有: 细胞遗传学法，h-y抗原法，x染色体相关酶法，y染色体特异dna探针特异杂交 法，pcr法3熊焰成，苏雷.家畜早期胚胎性别鉴定的研究进展j.上海畜牧曽医通讯，2006(6) : 22-23.等。其屮最为常

8、用的就是sry-pcr法，即通过扩 增位于y染色体上的性别决定区(sex-de termi nation region)的基因片段来判 定月丞胎或者细胞的'性另 0 4 kunieda t, xian m, kob ayashi e, et al . sexing of mouse preimplantation embryos by detection of y chromosomespecific sequences using polymerase chain reactionj.biology of reproduction, 19 92, 46(4) : 692-697.,该

9、基因在不同物种之冋咼度 保守 9 早在 1 9 9 0 年 he 匕1? 5 her*r c mr reed k c micronanipulation of bovine embryos for sex determinationj theriogenology, 1991/35(1): 45-54.等就是用该方法对家畜胚胎的性别进行了鉴定，准确率较髙。而用该方 法鉴定性别具有相对简单、快速、准确率高，灵敬等优点，可在实际应用中 广泛推广。同时也为法医鉴定、刑侦学断案和遗传学检测分析提供更高效可 靠的技术手段张大伟，向子东.耗牛胚胎性别鉴定pcr反应体系的建立j.畜牧兽 医学报,2011,5

10、(3):28-31.1材料和方法1.1材料1.1.1动物材料实 验 室 保 藏 的 新 鲜 猪 肉 组 织 1.1.2仪器和试剂台式高速离心机，pcr仪，水浴锅，电泳仪，涡旋振荡器，凝胶成像仪统， 微波炉，移液管，吸头，1.5ml离心管，250|il离心管，250ml锥形瓶，50ml 量筒,小烧杯，酒精灯，眼科剪，眼科银，浮漂等。tkm缓冲液(10 mm tris-hcl ph7.6, 10mm kc1, 2mm edta, 4 mm mgch), 10% sds溶液，饱和nacl溶液，75%的乙醇，无水乙醇，70%乙醇， te 缓冲液(10 mm tris-hcl ph 8, 0.1 mm

11、edta)；琼脂糖，tae电泳缓冲 液(40 mm tris-acetate, 1 mm edta), eb溶液(澳化乙锭)，灭菌双蒸水，dntp, 上下游引物，loxpcr buffer(mg"fiee),taq酶，m-dl2000 markero1.2方法1.2.1试验方案将购得的新鲜猪的肌肉组织进行基因组的快速提取，将所提的基因组作 为模板制备pcr反应体系，反应体系中的引物为预先设计好的两对特异性 引物，然后在pcr仪中进行dna的体外扩增，取pcr产物进行凝胶电泳 检测，对凝胶成像所得照片进行分析。1.2.2基因组dna的快速提取(1) 分别取猪肌肉组织(约1 mg),置于

12、1.5 mlep管中并剪碎。(2) 加入100 gltkm缓冲液，用200 pl移液器将剪碎的组织充分分散后， 再加入400 |1l tkm 和37.5 pl 10% sds,旋涡混匀。(3) 在水浴锅内55°c孵育5 mine力u200(1l饱和nacl,旋涡混匀。(4) 12000 rpm,离心5 min。取上清(约500 gl )加入新 1.5 mlep管 中(预先加入900(1l100%乙醇)，颠覆数次。(5) 12000 rpm,离心5 min。弃上清，力h500 gl70%乙醇，轻轻转动后， 吸去乙醇，倒置于滤纸上，置3 min,干燥。(6) 加 30 pl te 缓冲液

13、，55°cfi 10 min，备用。1.2.4引物设计根据gapdh (甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因序列(genbank登录号：af017079.1 ), 和sry基因序列(genbank登录号：u49860.2),用 primer premier 5.0,分别设计引物 gapdh-1,2 和 sryi,2, 引物由由南京金思特公司合成，引物序列如下：sry 上游弓| 物 (sry-1 ): 5 * gctttcattgtgtggtctcgt 3'sry 下游弓 i 物(sry-2)： 5 * cttggcgactgtgtatgtgaag 3，gapdh 上游弓| 物 (ga

14、pdh-1)： 5 ' gatggcccctctgggaaactgtg3 * gapdh 下游弓i 物(gapdh-2 )： 5 ' ggacgcctgcttcaccaccttct3'1.2.5 pcr的性别鉴定1. pcr条件的优化在50 pl反应体系中：1 pldna模板，引物各1 pl, mgcl23 pl, dntp4 pl, loxpcr buffer（mg2+free）, taq酶0.25 pl,灭菌双蒸水补加至50 pl。95°c 预变 性5 min； 95°c 变性35s,退火温度设为8个梯度（50.0°c、51.4

15、6;c、53.4°c、54.4°c、 55.5°c、56.7°c、57.4°c、58. tc ） 1 min, 72°c 延伸40 s, 30个循环；72°c 延伸 5 mino2. pcr性别鉴定选取上步的优化条件进行多重pcr,在50pl反应体系屮:1 |1l dna模板, 两对引物各 1 pl, mgcl23（1l, dntp4|il, loxpcr buffer（mg2+free）, taq 酶 0.25（1l,灭菌双蒸水补加至50（ilo 95°c预变性4.5 min； 95°c变性35s, 5

16、6°c 退火1 min, 72°c延伸40s, 30个循环；72°c延伸5 min。1.2.6电泳1. 制备1.5%琼脂糖凝胶：称取0.3 g琼脂糖置于锥形瓶中，加入20 ml的 lxtae电泳缓冲液，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.5%琼脂 糖凝胶液。2. 将少量eb （约3 nl）加入冷却到70°c左右的琼脂糖凝胶液中，摇匀。3. 胶板制备（灌胶）:将洗净的电泳槽载胶板放入制胶槽内，使载胶板 与内槽两端边缘对齐封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放 好点样梳。将琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入载胶板上，使胶液缓慢展开，直到 整个塑

17、料板表面形成均匀胶层。室温下，静置直至凝胶完全凝【古i,垂直轻拔点 样梳，将载胶板放入电泳槽中，lxtae电泳缓冲液没过胶板lmm为止。3. 加样：用10 pl微量移液管分别将样品（pcr扩增后产物）加入胶板的 样品小槽内，上样量为5pl,每加完一个样品，应更换一个加样吸头（注意： 加样前耍先记下加样的顺序）o4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压110 v,样品由负极（黑 色）向正极（红色）方向移动。当漠酚蓝移动到距离胶板下沿约1 cm处时（约20 min）,停止电泳。5. 观察照相：在紫外灯下观察，dna存在则显示岀红色荧光条带，采用凝 胶成像系统拍照保存。2试验结果pcr条件的

18、优化及pcr性别鉴定的结果见图1和图2图1： pcr退火温度条件优化结果图2：多重pcr结果figi: pcr products amplified from gradientfig2: multiplex pcr amplificationannealing temperaturem： dl2000 dna maker；m： dl2000 dna maker;1-8： s小鼠dna样品pcr扩增il3基因结果为16：待测上皮组织pcr结果；544bp的片段（退火温度分别为：50.0°c、51.4°c、7：已知？小鼠pcr结果；8：已知g小鼠pcr结果。53.4°

19、c、54.4°c、55.5°c、56.7°c、57.4°c、58.tc )（退火温度均为55.5°c）o9-16： s小鼠dna样品pcr扩增sry基因结果为402bp 的片段（退火温度分别:50.0°c、51.4°c、53.4°c、54.4°c、55.5°c、56.7°c、57.4°c、58.1 °c ）。 3讨论3.1鉴定过程的高效性这项性别鉴定技术用于快速、准确的鉴定小鼠的性别。对该pcr扩增程序 的所有步骤进行了优化使性别鉴定的时间低于4h。与其他的性别鉴定

20、方法相 比，它节省了大约2h。得出结果需耍以下几步：dna提取、pcr扩增和凝胶电 泳。对组织dna的快速提取采用sds变性、高盐的提取和乙醇沉淀法，可以在 lh之内得到低成本高纯度的dnao提取的dna量虽然很小，但用于pcr足够。pcr反应时，在找到两对引物合适的退火条件下同吋进行基因组dna的体外扩 增缩短了单独反应时所用的时间3. 2 pcr鉴定的准确性多重pcr同时扩增雌雄特异基因，使雌雄样品均有扩增产物，不仅可以避 免假阴性结果，同时提高了鉴定的准确率，而且可增加模板的使用率，使1个 或数个拷贝的dna获得最大限度的应用。由于pcr能使极少的目的基因大量 扩增，所以在实验操作过程中

21、要避免交叉污染。多重pcr要求在同一反应体系 中进行多个位点的特异性扩增，因而，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等 均影响多重pcr的扩增效果，但如能调整反应的循环参数（包括退火温度、退 火及延伸时间等）、pcr缓冲液成分、dntp的用量、引物的量及模板的量等， 选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重pcr扩增效果i®。3. 3注意事项（1）由于pcr反应高灵敏性，使扩增极易受到外源dna的污染，产生假阳 性。取样用的剪刀和银子必须做好实验前预处理，取样时应与所取样品一一对 应不得交叉使用，防止样品间的交叉污染。取过样品后离心管上要用标记笔做 好编号标记，以便鉴定后可对应区分

22、小鼠。（2）制胶前应将电泳槽、载胶板、点样梳子、凝胶槽清净晾干；所加缓 冲液应与电泳槽中的相一致；加热时，一定要煮沸，以保证琼脂糖的完全溶解; 待溶液冷却至不烫手时加eb；防止温度过高eb分解和挥发。溶解的凝胶应及 时倒入板中，避免倒入前凝i古i结块；倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电 泳结果。（3）取放eb时应该特别注意，有哪些位置是要戴手套，哪些是必须用手 接触的，小心摘手套时不要接触实验用具，以免交叉感染，对自己和他人的安 全造成隐患。（4）取放凝胶时，胶凝固后，拔梳子前先倒入些电泳缓冲液以方便取梳 子，拔梳子时，应垂直轻拔，防止破坏上样孔。（5）一般情况下，0.25 cm宽的梳子可加

23、0.1 pg的dna量，加样量的多少 依据加样孔的大小及dna中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔 超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的dna此现象更明显。（6）加样时每加完一个样品，应更换一个加样吸头，以防污染。加样时 勿碰坏样品孔周围的凝胶面。如预计上样孔过剩时，可避开第一个和最后一个 孔上样，防止边缘效应。（7）电泳期间接通电源，红色为止极，黑色为负极，切记dna样品由负 极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）。电泳20-40 min即可；电泳槽盖要安 全盖好，以防止液体蒸发，乂可以降低电击的可能性。参考文献1 吕碧文，俞颂东，金水仙.牛早期胚胎性别鉴定的pcr方法研究j.武汉大学

24、学报， 1994,45(2):211 214.2 胡明信，吴学清，曾溢滔等.牛胚胎性别鉴定与取样胚胎移植应用技术的研究j 畜牧兽医学报，1995,6:487495.3 赵建军，赵兴绪，张伟等.兔早期胚胎pcr性别鉴定体系的建立j.现代畜牧兽 医.2008,12:42 46.张大伟，向子东.耗牛胚胎性别鉴定pcr反应体系的建立jj.畜牧兽医学 报,2011,5(3):28 31.15徐艳春，马立新，白素英等.应用pcr方法通过毛发进行哺乳动物性别鉴定j.东北 林业大学学报,2000,6:72-77.6 alanr t, karen s. molecular diagnostics in prei

25、mplantation genetic diagnocularj.j mol diagn , 2002,4(2): 167176.7 jean-francois lambert, brian o. benoit, geralda. colvin, et al. quick sex determinationof mouse fetusesj. journal of neuroscience methodsj.2000,95:127132.8 赵学明，朱士恩，侯云鹏等.双重套pcr对不同取样胚胎性别鉴定灵敏度测试j.中国 生物工程杂志,2005,25(3):1722 .9 吕碧文.家畜胚胎性别鉴

26、定的分子生物学方法及现状j.浙江畜牧兽医，1998,(3):15-16.10 黄银花，胡晓湘，李宁等.影响多重pcr扩增效果的因素j.遗 传,2003,25(1):65-68.致谢这次毕业论文能够得以顺利完成，是所有曾经指导过我的老师，帮助过 我的同学，一直支持着我的家人对我的教诲、帮助和鼓励的结果。我要在这 里对他们表示最深的谢意！首先，要特别感谢我的指导老师一一潘求真老师。感谢潘求真老师在我 实验期间及毕业论文的撰写过程中，给我提供了极大的帮助和指导。从开始 选题到中期修正，从实验仪器的使用到实验药品的供给，直到最后论文的形 成，老师给我提供了许多宝贵建议和示范。其次，要感谢4053实验室的师哥师姐们在实验期间提供相关实验器材 和使用指导，使实验能够顺利完成。还要感谢人学四年里我的任课教师，是 你们每一次课堂上和课后的指导，让我学到了丰富的知识。得以有能力完成 这次实验。感谢我的父母亲，你们是我力量的源泉和依靠，只要想到你们永远支持 我，永远是我最坚强的后盾，不管面对什么样的困难，我都会勇往直前。感谢我的朋友们，大学四年我们一起学习，共同成长。学会了书本上的 知识，也收获了最珍贵的友谊。你们的鼓励与帮助是我前进路上最大的助力。 大学的结束不是我们友谊的结束，是新的开始