利用RAPD分子标记鉴定甜瓜、苦瓜种子纯度

1、利用rapd分子标记鉴定甜瓜、苦瓜种子纯度陈金体巫峡王晓峰摘要：甜瓜、苦瓜是华南地区两种重要的水果蔬菜栽培品种，具冇较高的营养价值和经济价值。木 实验以甜瓜、苦瓜种了为材料，通过改进种了 dna的ctab提取方法和优化rapd-pcr各因了(模板 dna浓度、引物浓度、dntps浓度、m尹浓度、退火温度、反应循坏数)，为实验室建立了较为稳定快 速可靠的水果蔬菜种子纯度rapd检测方法，为今后水果蔬菜rapd指纹建立打下基础。关键词：甜瓜苦瓜rapd分子标记种了纯度中国图书资料分类号 文献标识码甜瓜(cucumis melo l.)是葫芦科cucurbitaceae)甜瓜属中幼果无刺的栽培种，一

2、年生蔓性草 木植物，染色体数2n二2x=24,果实香甜，分为网纹甜j var. reticulatus naud.)、硬皮甜瓜 (raz; cantalupensis naud.)、冬甜瓜(var. in odor us naud.)、观赏甜瓜(拠 z: dudain naud.)、柠檬 瓜(var. chi to naud.)、菜瓜(var. flexuosus naud.)、香瓜(var. makuwa maki no)、和越瓜(回:conomon maki no)等8个变利苦瓜o伽】ord i ca c haran t i a) 乂名凉瓜，一年牛.蔓性蔬菜，染色体数2n=2x=22, 含

3、糖首量高，按果实形状和表面特征分为长圆锥形和短圆锥形两类。前者如广东滑身苦瓜、长身苦瓜 和长江流域的口苦瓜，后者如广东人顶苦瓜，均是优良的栽培品种。种了纯度(genetic purity of seeds)检测是指鉴定提供检样品屮木品种的种了数占提供检样 品总数的百分比。鉴定-批种子所属品种、利或属与标签上的标明是否相同，是否名副其实称为品种 真实性(genuineness of variety)鉴定。低纯度、真实性差的种子将给农业生产带来极大的损失。 为了防止假种子事件发生，保护广大农民的利益，提高和控制我国种子公司的种子质量，建立简便、 快速、准确、经济的种子纯度检测方法已势在必行。199

4、0年来，rapd (random amplified polymorphic dna)随机扩增多态性dna标记，已被证明是 植物系统学、分类与鉴定研究的一个有川而简便的工具九役它是利用人工合成的随机寡聚核昔酸片断 (910bp)作为引物,用未知序列的基因组dna为模板,通过pcr扩增后,得到具有多态性的dna1 一作者简介：陈金体(1983-12),女，华南农业大学生命科学学院02级生物技术专业，本科在读。 片断。rapd标记数量多，可以覆盖基因组中所冇位点，rapd标记是显性的，不能区别生物个体基因 型是纯合型述是杂合型的。该方法的优点主要是快速简便，无放射性污染，成本较低，分辨率高，灵 皱

5、度强，但由于其涉及到多种微量成分参加反应，会出现重复性差等一些问题。我们对pcr-rapd 中各关键因子进行了研究，根据自身实际，建立了一种比较简便快速，稳定准确的蔬菜种子纯度和品 种真实性的检测方法。1.实验材料与方法1. 1实验材料本文所试11个甜瓜品种、12个苦瓜品种,皆购自种子市场,详细信息如表1、表2：表1 11个甜瓜品种信息tab. 1 profiles for 11 cucumis melo l. types in the research品种品种特性果实近圆形，成熟时果皮成黄白色；果肉白绿色、肉厚、质细而脆果味醇香，汁多 运蜜一号适口；长势健壮，综合抗性好。一代交配，耐湿、耐热

6、，适应性强，抗蔓割病。果空丰满整齐，果皮光滑，白绿微 新解甜瓜带黄色，肉色淡白绿，肉质松脆。一代交配梨甜瓜（美浓瓜），结果力强。果实丰正微扁球型，成熟时皮 银辉色银口，不易裂果，肉色淡口绿，肉质松爽细嫩，香甜可口。一代交配，早生强健，耐湿、耐热，结果力强，果皮银白色稍带黄色，肉质松脆可 新玉甜瓜口，果梗不易脱落，不易裂果，抗蔓割病及病毒病。原种，早熟品种，果实圆形，大而周正，果皮白色，质脆爽口，味香甜，抗逆性强， 白沙蜜耐贮运。从白沙蜜屮历经三年套袋提纯的白瓜。高抗病毒、霜霉、枯萎，早熟，果型人而均 白雪一号7 匀，雪白透亮，香甜可口。白雪一号与国外材料杂交定向选育，高抗病毒、霜霉、白粉、枯萎

7、，果圆型，籽、 赛雪皐后肉均口色，皮雪口透亮，果实清脆爽口，味香甜，耐贮运。果肉脆，果皮韧，耐贮运，植株长势旺，果皮白绿色，果面冇浅条纹，成熟后略变 津甜一号黄。肉色浅绿，口感酥脆，风味好。一代交配，果实近圆球型，皮色白绿，果肉青翠，甜度高，肉质松脆，座果高，不 一湾青玉易裂果霉烂，抗病力强。杂交一代，果实苹果型，果皮绿白色微透黄亮，果肉清脆香甜，易座瓜，抗病强，傲雪碧玉不易裂果、烂瓜。果实近似圆球型，皮色口绿，果肉青翠，甜度高肉质松脆，座果高，丰产，不易裂h本甜宝果霉烂，抗病力强。表2 13个苦瓜品种信息tab. 1 profiles for 13 momordica charantia t

8、ypes in the research品种品种特性旺优大厚肉2号杂交一代，果实硕大，近圆柱状，皮色浅绿，h有光泽，果肉丰厚致密，耐贮运，ihi质优，产最最高的汕瓜新品种。南珠苦瓜杂交一代，瓜形大，皮色油绿冇光泽，柳条粗直，外观美观，肉厚、质脆。杂交一代，屮熟，耐热，丰产，长势旺盛，瓜人，长纺锤型，皮色浅绿，瓜形均匀绿华夏(668)一致，抗逆性强。代交配，长身油瓜，条瘤粗直厚大，瓜肩稍平，瓜底较钝，味浓郁，是目前最早绿中宝熟的汕瓜。杂交一代，油绿苦瓜，中早熟，瓜头尾匀称，形状美观，味林爽口，微苦，结瓜多，槟优一号延收期长。岀口型，早熟、耐寒、耐热、耐湿、长势旺盛，高抗枯萎病、口粉病，箱霉病，抗

9、泰国大肉王逆性强，瓜长棒形，头尾均匀，高产稳产。一代交配，原种从台湾引进，瓜长棒形，具有早熟、高抗病、瓜码密、肉厚、丰产台湾翡翠等优点，是目前蔬菜基地理想的首选品种z。早生长身苦瓜，台湾品种，机旱生，生长强健，丰产，果实出长形，果色玉白带绿高华色，果面细吃刺瘤突起平滑，略有肋条。原种美国引进的一代杂交种，抗低温弱光能力强，极耐热耐涝，喜大水大肥，挂长美工绿剑圆棒型，瓜身坚实，空心极小，周身不满疙瘩，刺瘤丰满可爱，微苦、lt脆。瓜圆林形，较粗实，色泽绿口亮净，纵瘤明显，表面麻子均匀，品质优良，能适应长白苦瓜全国各地春秋栽培。鼎丰大顶瓜圆锥形，翠绿有光泽，条纹粗直。具有高产，瓜形美，快人，肉厚不易

10、裂，翠绿。 杂交一代大顶苦瓜，耐热，主侧蔓均可结瓜，果实圆锥形，顶特大，肉特厚，瘤条翠绿一号粗直，皮色油绿且有光泽，最适宜出口。代交配，生长势强，瓜短圆锥形，条瘤初有，瓜形美观，皮绿有光泽，肩平人、 五山黑籽大顶肉厚且致密，耐贮运。1.2主要仪器设备5415r型eppendorf高速冷冻高速离心机、涡旋器(scientific industries, tnc.)>电泳仪(大连 捷达 jmx, scientific instruments)> pcr 仪(mj research ptctoo)、微波炉(national)> 数显 恒温水浴锅(国华电器hh-l)、-20°

11、;c低温冷柜(sanyo)、磁力搅拌器(六一仪器厂)、培养皿、恒温 培养箱、烘箱、研钵、通风橱。1.3主要试剂三疑甲基氨棊甲烷(tris)、乙二胺四乙酸(edta)、十六烷基三甲基滉化鞍(ctab)、硼酸、聚乙 烯毗咯烷酮(pvp)、p一疏基乙醇、氯化钠(nacl)、盐酸、氢氧化钠(naoh)为国产分析纯；琼脂糖 为sigma公司产品;dl2000 dna maker> taq酶、dntp> mg2+为日本takara宝生物工程(大连)有限 公司产品，taq酶北京天为时代科技有限公司的。1.4实验方法1.4. 1 d7a提取缓冲液的配制dna 提取缓冲液配制：称取 ctab 4 g

12、, tris 2. 42 g, edta 1. 169 g, nacl 16. 38 g, pvp 4g 溶 于160 ml双蒸水中，用盐酸调ph值到8.0,并用双蒸水定容到200 ml,装入棕色瓶中，11公斤/ 平方厘米灭菌20分钟。4°c保存。使用前，预热至65°c,取出适当体积，加入1%体积比的b疏基乙醇。1.4.2 dna的提取宙叫以苦瓜种了为参考，甜瓜种了稍小，加样蜃略少)选取一粒种子，剥売，在研钵上先用液氮迅速磨至粉状，转移至1.5 ml灭菌离心管屮，加入500)11 预热至65°c的种子dna提取缓冲液洗涤研钵，离心管中混匀。混合溶液于65°

13、;c水浴孵育15 niirio向上述反应体系中加入0.25倍体积(即125gl)酚/氯仿/异戊醇(25/24/1),混匀，12000 rpm, 室温离心10 mine取上清液再按相同方法用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽提一次。将上清液转移至新的1. 5 ml灭菌离心管中,加0. 6倍体积冷的异丙醇,混匀,12000 rpm 4°c离心 6 min。加70%乙醇1 ml,洗涤沉淀2次，12000 rpm离心1 min。弃上清,风干总dna。加灭菌的lxte20pl溶解，在4°c下贮藏备用，或在-20°c下长时间保存。（提取时间约为40 min）1.4.3 pc

14、r反应条件的优化1.4.3. 1初始扩增反应pcr反应液的总体积为25卩1,其组成如下表表3 pcr-rapd初始反应体系tab.3 pcr-rapd initial systempcr反应液的组成反应液中的用量dna template (约 30 ng)1 mtaq dna polymerase (5 u/l)o.2 mloxreaction buffer (mg)2.5 mdntp mixture (2. 5 mm)1.5 mprimer (1 pm)1 mmgcl2 (25 pm)2.o mddh.0add to 25 alpcr反应条件如下：94°c预变性3 min；94&#

15、176;c变性 1 min, 37°c复性 1 min, 72°c延伸 2 min, 40 个循环;72°c延伸 10 min；4°c保存。1.4. 3.2反应混合物中各组分浓度搭配的筛选1.4. 3. 2.1单因素实验设计法（苦瓜）1.4. 3. 2. 1. 1退火温度优化在初始扩增体系下，尝试变化退火温度，以求获得最大数量和最清晰的多态dna。尝试的追火温度：34°c, 35°c, 36°c, 37°c, 38°c, 39°c, 40°c, 41°c, 45°c

16、, 48°c。1.4. 3. 2. 1.2 引物浓度的优化在最优退火温度下，尝试变化引物浓度，其它反应条件不变。尝试的引物浓度：6 网/1, 8 mm/1,10 m1/1,12 网/1, 14 pm/lo1.4. 3. 2. 1.3 dntps 浓度的优化在最优退火温度、引物浓度条件下，尝试变化dtps浓度，其它反应条件不变。尝试的 dntps 浓度:100 pm/1, 150 m/1,200 mm/1,250 刚/1, 300 网/1。1.4. 3. 2. 1.4 模板浓度的优化确定了最优退火温度、引物浓度、dntps浓度后，尝试变化加入的模板量，其它反应条件不变。 根据与mark

17、er dl2000电泳条带比较,可估算加入每管反应的模板梯度量为为：10 ng, 20 ng, 40 ng, 80 ng, 160 ng, 320 ng。1. 4. 3. 2. 1. 5 taq dna polymerase 浓度的优化建立了最优退火温度、引物浓度、dntps浓度、模板浓度后，还需:要对taq dna polymerase浓 度进行调整，其它反应条件不变。尝试对每个不同的反应管加入不同taq dna polymerase量:0.25 u, 0. 5 u, 1 u, 1. 5 u。1.4. 3. 2. 1.6 mg"浓度优化在以上最优条件下，対浓度进行实验，其它反应条件

18、不变，尝试以下的浓度梯度：1.5mm/l, 2. 0 mm/1, 2. 5 mm/1, 3.0 mm/1, 3. 5 mm/1, 4.0 mm/lo1. 4. 3. 2. 1. 7 pcr-rapd扩增循环数优化基本确定了最优pcr扩增体系后，还需要对扩增循坏数进行优化，尝试了一下儿个循环数：30, 35, 40, 45, 50o1.4. 3. 2. 2. 1正交实验设计法(甜瓜)采用u (34)正交实验设计，对dtp mixture浓度、引物浓度、mg"浓度、taq dna聚合酶浓度进行了筛选，找出最佳组合。试验屮设两个重复，还有一个空白对照。方案如卜i表4各组分浓度水平tab.

19、4 concentration of every reaction elements水dntp mixture(mi)primer(mm)(mm )taq dna polymerase(u)1500.21.51.021000. 32.01.531500.42.52.0表5各组分正交设计方案tab.5 design of orthogonal experiment表头设计dntp mixtureprimermg*taq dna polymerase号处理1 (mm)2 (ml)3 (mm)4(u)11 (50)1 (0.2)1 (1.5)1 (1.0)21 (50)2 (0.3)2 (2.0)2

20、 (1.5)31 (50)3 (0.4)3 (2.5)3 (2.0)42 (100)1 (0.2)2 (2.0)3 (2. 0)52 (100)2 (0.3)3 (2.5)1 (1.0)62 (100)3 (0.4)1 (1.5)2 (1.5)73 (150)1 (0.2)3 (2.5)2 (1.5)83 (150)2 (0. 3)1 (1.5)3 (2. 0)93 (150)3 (0.4)2 (2.0)1 (1.0)1.4. 3. 2.2模板dna浓度优化还通过琼脂糖电泳检测dna浓度，对pcr体系中dna浓度进行了优化，dna浓度分别为10 ng,约 15 ng,约 30 ng,约 60

21、ng,约 120 ng。1.4. 3.2.3退火温度优化再次进行了退火温度的优化，所用温度为35°c, 36°c, 37°c, 38°c, 39°c, 40°c。1.4.4 pcr反应引物的筛选在敲优的扩增条件下，对pcr反应引物进行筛选。引物由上海生工生物公司合成。木文所筛选的引物如下表：表6 rapd分子标记所用的引物tab.6 primers in the researchsan gon编号序列(5'to 3')w97107ggt ccc tga cw97284cat ccc cot gw97286tgc gcc

22、 ctt cw97287tgc tct gcc cw97288ggt gac gca gw97290tgg ggg act cw97291ctg ctg gga cw97294cat ccc cgc tw97295ttcc gct ctg gw97302ccc aag gtc cw97303ggt gcg gga aw97224cag agg tcc cw97225cac ccc ctt gw97230tcc tgg tcc cw97232agt cgg gtg gw97237agg ggg ttc cw97238tgg gga cca cw97255ccc ctc acg aw97246tc

23、c gag agg gw97247acg ccc agg tw97248gaa gcc agc cw97249gga cgg cgt tw97251gga cct gct gw97253acc ccc cac tw97255aga tcc cgc cw97256cag tgc cgg tw97260ggg tgt gca gw97263cat cgc cgc aw97266ggc tgc gac aw97270agc agc gca cw97274ggg tot cgg tw97276agt cgc cct tw97280tga ggg tcc c1.4.5种子纯度和真实性检测木实验的最终h的

24、是找到快速简便、稳定可靠的种了纯度和真实性检测。建立在良好的反应体系, 特异的多态性引物基础上，pcr-rapd将是一个很好的选择。方法是，按照本实验摸索的种子dna提取法，pcr-rapd扩增条件，特异引物对某一假设蔬菜品种 进行检测。本实验首先対某一甜瓜品种进行了检测。这一过程在数小时内即可完成。今后如果建立了足够大的rapd分子文库，这样的检测手段将会变得更加全面和高效。1.4.6琼脂糖凝胶电泳取5a1pcr扩增产物，加入1 w 6x loading buffer,点样板上混匀,进行点样。胶浓度为14%。电泳时，先把电压调至140 v左右，待样品跑出点样孔后，再调节电压至100 v （约

25、35v/cm）, 电泳40 min左右即可取出凝胶，在bi0-rad凝胶成像系统上打描成像并保存。2结果与分析2.1甜瓜种子的外观形态图1 11个胡种甜瓜的种子图fig. 1 11 cucumis melo l. seed appearance图2 13个品种苦瓜的种子图fig. 2 13 momordica charantia seed appearance从图不难看到，11个甜瓜品种的种子在形状上很相似，皆为椭圆形，在种子大小和颜色上有一定 的差别，但差别不明显。因此，利用甜瓜种子的外观形态特征不可能将11个品种区别开。苦瓜种子的 外观形态区别稍大，但亦难直接通过形态标记来区分每一种类和种

26、内的纯度。分子标记能反映生物 个体或种群间基因组中某种差异特征的dna片段，它直接反映基因组dna间的差异。pcr-rapd 分子标记是检测的一个重要手段。2.2提取的苦瓜dna图取提取的1.5 m dna、3.5 m蒸憾水、1 m 6xloading buffer,点样板上混匀，进行点样。提取的dna质量如下图所示：图3提取的苦瓜dna图（ex代表提取的苦瓜dna, m为dl2000 marker）fig.3 dna extraction from momordica charantia(ex: extracted dna from momordica charantia m: dl2000

27、 marker)2.3 pcr反应体系的优化2. 3. 1 pcr反应退火温度的优化退火温度低，引物和模板结合特界性较差，出现的条带可能增多；退火温度高，引物和模板结合特异性增加。在pcr-rapd屮，退火温度尤为重耍，因此本实验対退火温度做了大量的研究。一湾青玉新玉甜瓜图4不同的退火温度対两个甜瓜品种rapd结果的影响(甜瓜)引物:w97291；模板：湾青玉,新玉甜瓜；m： dl2000 dna markerfig4 rapd results of different annealing temp. (cucumis melo l.)primer: w97291; template: yid

28、aiqingyu, xinyu; m: dl2000 dna markerm 34t 35t 36c 37t 38t 39c 妣 41t 45t 48t 图5不同的退火温度对rapd结果的影响(苦瓜)引物:w97107；模板：五山黑籽大顶；m： dl2000 dna markerfig.5 rapd results of different annealing temp. (momordica charantia)primer: w97107; template: wushanheizi; m: dl2000 dna marker图4、5中可以看到不同的退火温度的条件卜，扩增带区别明显。对于甜

29、瓜,39°c、40°c的两个处 理在两个甜瓜品种中能扩增出5条带，条带的量大，稳定性好。这两个都可以作为较佳退火温度，接 下来的甜瓜实验选用39°c为退火温度。对于苦瓜，36°c、40£、41°0都是较好的选择，结合甜瓜实验 和其它引物的扩增情况，最后选取/ 40为以后实验的退火温度。2.3.2引物浓度的优化m 6810 12 14 ck图6不同的引物浓度对rapd结果的影响（苦瓜）引物:w97107；模板：五山黑籽大顶；m： dl2000 dna markerfig. 6 rapd results of different prim

30、er concentration （momordica charantia）primer: w97107; template: wushanheizi; m: dl2000 dna marker引物浓度对rapd扩增质量的影响还是比较明显的。引物如果浓度过低，则无法与所冇模板dna结 合，影响扩增质量；如果浓度过高，则引物二聚体的形成会降低扩增的有效性从图6看到，从 10mi/l后出现了一条特异扩増带，结合条带清晰和成本考虑，故选择10m 引物浓度为以后苦瓜rapd 的主要浓度。2. 3. 3 dntps浓度的优化图7不同的dntps浓度对rapd结果的影响(苦瓜)引物：w97107 ；模板：

31、五山黑籽大顶;m： dl2000 dna markerfig. 7 rapd results of different dntps concentration (momordica charantia)primer: w97107; template: wushanheizi; m: dl2000 dna marker作为pcr反应的原料，dntps的浓度直接影响扩增产物的牛成。随着dntps浓度的升高，扩增产 物亦增加;但是浓度过高时,dntps容易与mh结合,降低taq酶活和产物的生产。因此，必须选择合适的dntps的浓度。如图7, 200 mm/l扩增带最多尺清晰，所以木实验的苦瓜部分选

32、择200 mm/l为主要的dxtps反丿应浓度。2. 3. 4 dna模板浓度的优化>10 15 30 60 120 m图8模板浓度（单位：ng）対rapd的影响（甜瓜）引物:w97291；模板：日本甜宝；m： dl2000 dna markerfig8 rapd results of di fferent template conccntration （cucumi s me io l.）primer: w97291; template: rriben tianbao; m: dl2000 dna markerm 10 20 40 80 160 320m 10 20 40 80 160

33、 320 ck图10模板浓度（单位：ng）对rapd的影响（苦瓜）图9加入的模板浓度梯度（单位：ng）（苦瓜）引物：w97107；模板：五山黑籽大顶；m： dl2000 dna markerfig.9 template concentration in ng （momordica charantia）fig 10 rapd results of differont template conccntration （momordica charantia）primer: w97107; template: wushanheizi; m: dl2000 dna marker述采用曰木甜宝品种对模板d

34、na浓度进行了优化（图9）。对于rapd扩增进行了不同dna浓度的 试验，过低或过高的dna浓度均导致没有扩增产物，只有理想的dna浓度才能产生可重复性的rapd 指纹。从结果中可以看到dna浓度小于10 ng时，没有扩增的带;dna浓度约为15 ng时扩增的带比 较模糊不清;dna浓度约为30 ng、60 ng. 120 ng时,扩增出来的带都比清晰。但考虑到dna的用量, 最佳的选择就是30 ng。苦瓜相似的实验在五山黑籽人顶中进行，从10ng160ng,均有比较漂亮的扩增带。320ng开始, 扩增特弄性变化。所以，认为40ng左右的模板dna量是较好的选择。m 0.25 0.50 1.0

35、0 1.502. 3. 5 taq dna polymerase 浓度的优化丄单位（u）图11酶量对rapd的影响（苦瓜）引物:w97107；模板：五山黑籽大顶;m： dna marker （dl2000）fig. 11 rapd results of different taq polymerase concentration （momordi ca charant id）primer: w97107; template: wushanheizi, xinyu; m: dl2000 dna markertaq dna polymerase可以认为是整个pcr-rapd屮最为重要的因子，其活性

36、与川量决定着扩增质量的根本。图11中0.25u, 1.0u, 1.5u四个实验浓度均有扩增带，0.5u没有岀现扩增带很可能是实验错谋操作所致，与酶最无关。但考虑到成木及稳定性，选用1.0u的酶量，这与许多其它文献的报导一致。2. 3. 5 mg"浓度的优化m 1.5 22.5 10 3.5 4单位(mm/l)图12 mg?浓度对rapd的影响(苦瓜)弓i物：w97107；模板：五山黑籽大顶;m： dna marker (dl2000)fig.11 rapd results of different mg" concentration (momordica charantia

37、)primer: w97107; template: wushanheizi, xinyu; m: dl2000 dna marker虽然在pcr屮主要的功能是与taq酶结合，促进反应的进行。但是，过高浓度的mg'也会与 其它反应成分作用，如dntps、dna模板等，影响反应的顺利进行。所以，合适的卜浓度很重要。图 12中陆离子实验浓度区别不大，最后选择1.5 mm/l的。2.3.6 pcr-rapd扩增循环数的优化当实验各组分的反丿应浓度基木确定示，减少所需的反应扩增时间是提高rapd检测有效性的一个 重要手段。到目前为止，此部分实验还在进行当屮。2.3.7对dntps mixtur

38、e、引物、mg2 taq dna聚合酶的浓度的正交优化实验采用l9 (34)正交实验设计，以一湾青玉品种研究了不同dntp mixture、引物、mg"和taq dna 聚合酚的浓度对pcr结果的影响。ck是用双蒸水代替dna,检验各成分中有没有被dna污染的。处理 号参照本文表5。正交表中的处理号112233445566778899 ckm图13不同的浓度组合对rapd的影响引物：w97291；模板：一湾青玉;ck：空白对照；m： dna marker (dl2000)fig.13 results in the orthogonal experimentsprimer: w9729

39、1; template: yiwanqingyu; m: dl2000 dna marker图13的结果表明，在9个处理中，主要的4大影响因索因浓度组合不同，扩增效果差异比较明显。 处理6、8岀现不能重复的现象。为避免偶然性，分别对其进行了重复试验，两个处理都没有出现不能 扩增的现彖。在所有组合中，各个组合多态性都比较好，都具有3条或以上的带。但是考虑到实验的 重复性，带型的清晰度等因素，还要考虑到taq dna聚合酶川量，授后决定选择处理9。处理9的谱带 清晰、重复性好、多态性高，是九个处理中最理想的浓度组合:即反应总体积25其中含10x扩增缓冲液 2. 5 m, mg2 + 2 mm/l,

40、 dntp mixture 150 mm/l,引物为 0.4 m-m/l, taq dna 聚合酶 1 u,模板 dna量为30 ng, -h他成分为无菌蒸馅水。2.4 pcr反应引物的筛选随机引物数量多，而且并不是所有的随机引物都具有特-wo因此，必须进行引物筛选，找到具冇特异性的随机引物来进行种了纯度鉴定。本实验对11种甜瓜品种进行了筛选。图14引物w97274的pcr扩增结果图15引物w97225的pcr扩增结果fig.14 results with w97274 primerfig.15 results with w97225 primer图16引物w97255的pcr扩增结果图17引

41、物w97295的pcr扩增结果fig.16 results with w97255 primerfig.17 results with w97295 primer图18引物w97276的pcr扩增结果fig.18 results with w97276 primernote: al 1 markers above are dl2000 dna marker引物w97274在11个品种中可以扩增出5条或以上的带。在白沙蜜、白雪一号和赛雪皇后3个品 种屮可以明显看到多了一条特征带。因而，引物w97274将11个阳种分成两类：运蜜一号、新辉甜瓜、 银辉、新玉甜瓜、津甜一号、一湾青玉、傲雪碧玉和日本甜

42、宝一类，白沙蜜、白雪一号和赛雪皇后一 类。引物w97225可以将一大类分成了三小类：运蜜一号和新辉甜瓜一类，银辉、新玉甜瓜和日本甜宝 类，还冇津甜一号、一湾青玉和傲雪碧玉一类。再用引物w97255已经可以将运蜜一号和新辉甜瓜区分开，将li木甜宝与银辉、新玉甜瓜区分开, 将傲雪碧玉与津甜一号、一湾青玉区分开，将白沙蜜与白雪一号、赛雪皇后区分开。另外再用引物w97295可以将银辉、新玉甜瓜区分开，将白雪一号、赛雪皐后区分开。用引物w97276将津甜一号、一湾青玉区分开。就这样，通过这5个具有特异性的引物就可以将 11个薄皮的甜瓜品种区分开。因此,通过使用引物w97274、w97225、w97255

43、. w97295和w97276,我们可以将所试11个甜瓜品种逐一区分开，具体见图10所示呵:w97274w97225w97255w97295w97255运蜜一号新辉甜瓜厂银辉1新玉甜瓜日本甜宝w97276津甜一号w97255一湾青玉傲雪碧玉w97255白沙蜜w97295白毛1-赛雪皇后图19 11个甜瓜品种的分析图fig. 19 analysis process of 11 cucumis melo l.苦瓜这部分的实验也正在进行当小。2. 4甜瓜种子纯度的检测根据特界引物，我们可対某一甜瓜品种进行纯度和真实性检测。j图20甜瓜种了纯度检测引物:w97295；模板：银辉;m： dna mark

44、er (dl2000)fig. 20 result of the cucumis melo【“seeds purity testingprimer: w97295; template: yinhui; m: dl2000 dna marker图21甜瓜种子纯度检测引物：w97295；模板：银辉；m： dna marker (dl2000)fig. 20 another result of the cucumis melo l. seeds purity testingprimer: w97295; template: yinhui; m: dl2000 dna marker通过rapd的快速检

45、测，可知检测的种子纯度约为83. 3%o3讨论由于rapd是胃接以基因纟fl dna为模板扩增的产物，所以用rapd分了标记方法鉴定的结果可 靠，不受环境的影响。rapd标记涉及pcr反应屮的变性、退火、延伸的温度和时间，以及反应过程 循环数，反应体系中的多种试剂來源、浓度,mg?+浓度、模板dna的量和纯度等诸多因素的影响。因 此，有的学者认为rapd灵敏度高，但可重复性差。但本研究表明：只耍反应条件适当，反应体系中多 种试剂來源和浓度保证一致并严格控制反应程序的各个环节及各个循环参数的稳定性，重复结果是不 难得到的。在pcr反应程序中，退火温度的影响最为明显。由于rapd是寻找特异性扩增带

46、的过程， 所以合适的退火温度尤为重要。根据实验情况，39°c. 40°c是很好的选择。其它程序像变性、复性和 扩增的温度、时间以及循环的次数，变性和延伸温度等对实验的影响相対退火温度而言较少。至此， 本实验基本上以完成了对pcr-rapd反应条件的摸索，建立在各最优浓度和组合下的rapd反应，有 效性和稳泄性均有较好的保证。rapd 分析应用于厚皮甜瓜 british queen> earps favouritecrenshaw> pak istan2981）卩习及 earl's favourite的3个品系（春系3号、磐田2号、夏系722）间的比较。刘

47、富中等利用rapd鉴定厚皮甜 瓜杂交种中蜜1号、中蜜2号、中蜜3号及其亲本的遗传纯度，建立了快速鉴定甜瓜纯度的技术体系, 构建其特有指纹图谱，为甜瓜品种保护和杂交制种屮纯度和真实性的快速准确鉴定提供了技术保证。 乐锦华等利用20个随机引物对厚皮甜瓜8个亲本与4个杂交种进行了 rapd分析，结果表明，可以 利用rapd标记在dna水平上进行厚皮甜瓜亲缘关系的鉴定。刘万勃说利用rapd和issr两种分子标 记技术对37份甜瓜种质进行了多样性研究。在供试材料屮筛选到具有多态性的rapd引物21个，issr 引物10个等等。本研究可以用5个特异引物将11个甜瓜品种(文献上没有被研究过的)区分开來， 而

48、且可以用有特异性扩增的引物检测了其中一个品种，结果显示rapd分了标记在用在甜瓜种了检测。 这种方法也町以对市面上销售的甜瓜品种进行种子纯度鉴定。用rapd分子标记鉴定种子纯度，有两种情况口7，询：一是有父母本种子时是要寻找到至少一条 dna特征带，通过対f1种子和父母本种子dna带型的比较来鉴定珀种子纯度。但是本研究是市场上 所销售的种了，缺少父母木。二是rapd应用于儿常规品种种了纯度检验时，要求选择hl标品种a的 rapd图谱中出现而其他常规甜种中不出现的dna谱带作为鉴定纯度用的特界谱带。为保证检测结果 的真实性和町靠性，寻求特异谱带的研究屮通常应选川较多的其他非fi标常规品种。为此，

49、本研究就 是通过pcr优化条件卜筛选出一些引物能将11品种区分开來。再用能区别不同品种的引物检验其中 -种品种的种子纯度。结果显示该方法能应用在甜瓜品种纯度上。4.参考文献1 王志敏、牛义、宋明等rapd技术在蔬菜研究中的应用j西南园艺.2005, 33(5):21-22, 29.2 苗玉新、刘丽艳、包春莲.pcr和rapd技术在农业研究中的应用j.农业系统科学与综合研 究.2005, 21(5) :231-234.3 辛景树、郭景伦、张软斌.儿种常用分了标记技术在种了纯度和品种真实性鉴定方面的比较与分析 j种子.2005, 24 (1)： 58-60.4 孙妮、胡开林、张长远.rapd技术鉴

50、定苦瓜杂种一代的研究j.广东农业科学.2005, 1:40-43.5 熊劲仿、向育君、张正奇.花牛总dna的快速提取与纯化研究j.牛物学杂志.2003, 20(2):32-34.6 张凤娟、张满良、朱水芳一种改进的水稻总dna的快速提取方法j.植物检疫.2004, 18(6):330-332.7 丁群英、张显.分子标记技术在西瓜甜瓜上的应用j果树学报.2005, 22 (3)： 271-275.8 张菊平、巩振辉、张长远等.苦瓜rapd分析体系的优化研究j河南农业大学学报.2003, 37(1):49-53.9 曾兵、张新全、彭燕等.鸭茅rapd分了标记反应体系优化j.安徽农业大学科学.2005, 33(7):1151-1153.10 侯大斌乌头基因组dna提取与rapd反应体系优化j西南科技大学学报.200