第二讲微生物的培养与应用

1、双基落实系统化问题化基础知识系统化知识点一微生物的实验室培养1.培养基碳游.氮源.水无机盐、生kwt培养棊竺型lg理 液体培养基性质分鉴别培界m&务一条件ph.特殊营恭物质及舗（等按功2. 无菌技术恋沸消毒法化学药剂消话法紫外线消毒法区别：能否杀死3. 大肠杆菌的纯化培养计寡纯一溶化-灿倒平板i制备尚体培界用宵m知识点二 土壤中分解尿素的细菌的分离以尿索为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂i 土壤取样f样品稀程it取样接种f培养观察f菌种鉴定培养基以尿素为唯二氮源的选择培养基接种方法稀椎涂布平板疫知识点三分解纤维素的微生物的分离1实验原理2.实验流程1刚果红染色法丙法纤维索稱1复合静，至

2、少包括g酶、 :c m和简萄撕仔鹽: i纤维索罟纤维二糖匹塑他钿鬻加樂d乜址红色消“现观土壤取样一富含纤维素的环境选择培养一用以纤维索为唯一碳源的选择培养基培 养，以增加纤维索分解菌的数量梯度稀释1i将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的固体培涂布平板j养基上挑选1挑选出产生透明圈的菌落基本技能问题化1. 据某微生物培养基的配方表回答下列问题编号成分(nh4)2so4kh2po4feso4cacl2h2o含量0.4 g4.0 g0.5g05g100 ml(1) 此培养基按物理性质划分属于邂培养基，因为没有凝固剂(如琼脂)；按功能划分属 于选择培养基,因为没有碳源，只有宜养型微生物才能生长(利用空气中的

3、co2)o(2) 此培养基含有的微生物的营养成分包括水、无机盐和氮源三类,若加入氨基酸，则 它可充当的营养成分包括翹、氮源和生长因子。(3) 若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是凝固剂(琼脂)。(4) 若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中成分(填表中序号)，加入尿素和不含氮元素的有机物。2. 下图是倒平板的操作，请据图填空(1) 请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙乙一甲一丁。(2) 甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。(3) t中的操作需要等待平板冷却凝固后才能进行。3据两种接种方法产生的培养效果图完成下列问题(1) 获得图a效果和图b效果的接种方法分别是稀释涂布平板法、

4、平板划线法。(2) 某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什 么？应当怎样操作才可避免此种现象。提示：最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灭菌。采取 的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灭菌。4. 连线以下几种选择培养基和鉴别培养基及其应用|培养基| 加入青林索 加入高浓度食盐 以尿素为唯-氮源/ 以纤维索为唯碳源 不添加氮源、乩分离金黄色他曲球菌 b.分离尿素分解菌c.分离纤维索分解菌 (i.分离酵母曲和15询 巳.鉴别纤维索分解询 f.鉴别尿素分解菌 &分离固氮微生物h.鉴别大肠杆菌题点化重点化考点一培养基及微生物的纯

5、化培养技术命题点(一)培养基的成分、功能和制备1. (2016全国卷i)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小 组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。 实验步骤如下： 配制培养基（成分：牛肉膏、蛋白腺、nack x、h2o）； 制作无菌平板； 设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作； 将各组平板置于37 °c恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。回答下列问题：（1）该培养基中微生物所需的氮来源于o若要完成步骤，该培养基中的成分x通常是o（2）步骤中，实验组的操作是o（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均

6、数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了 6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了现象。若将30（即36-6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法（填“正确”或“不正确”）。解析：（1）牛肉膏和蛋白膝中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白 膝。若要完成步骤，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼 脂。（2）该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别 放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。（3）若空白对照组的平板上出现了菌落， 说明实验过程中出现了污染现象。空白对照组的一个平板上出现了 6个菌落，导致实验变 量不唯

7、一，不能确定实验组平板上的菌落是否仅由教室内不同高度空乞中的微生物形成， 因此不能求出实验组的菌落平均值。答案：（1）牛肉膏、蛋白腺 琼脂（2）将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置 上，开盖暴露一段时间（3）污染不正确2. （2016-全国卷iii ）某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化 所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。 回答下列问题：（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是o（2）推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有和o分离纯化时应挑选出的菌落作为候选菌。（3）乳酸菌在一2

8、u °c长期保存时，菌液中常需要加入一定量的（填“蒸馅水” “甘油”或“碳酸钙”）。解析：（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释，这样既可 避免杂菌污染，又可将乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单个菌落。（2）乳酸 的积累影响乳酸菌的增殖，加入碳酸钙可以中和乳酸菌代谢（无氧呼吸）过程中产生的乳酸，另外，乳酸和碳酸钙反应，进而导致碳酸钙分解形成透明圈，有利于乳酸菌的鉴别和分离。（3）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在3ml的甘油瓶中，装入iml 甘油后灭菌。将1 ml培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在一20 °c的

9、冷 冻箱中保存。答案：（1）无菌水 泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落（2）鉴别乳 酸菌 中和产生的乳酸（或酸）具有透明圈（3）甘油重难点拨i常用选择培养基与鉴别培养基实例归纳类型实例选择培养基培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利 用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物鉴别培养基伊红 美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌（菌落呈黑色

10、）命题点（二）无菌技术的操作3（2014-江苏离考节选）为了获得p 胡萝卜素产品，某小组开展了产p 胡萝卜素的筛选与色素提取实验。请回答下列问题:（1）实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是;为了减少灭菌后器皿被污染，灭菌前应该。（2）为了筛选出酵母菌，培养基中添加了青霉素，其目的是。乙丙 软灭菌桶甲（3）右图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图中甲、乙、丙指示的依次是o （填序号） 安全阀、放气阀、压力表 放气阀、安全阀、压力表 安全阀、放气阀、温度表 放气阀、安全阀、温度表（4）为了将分离到的菌株纯化，挑取了菌落在3块相同平板上划线，结果其中一块平板的各划线区均未见菌生长，最可能的原因是解析：（1）

11、实验室常用的灭菌方法是干热灭菌和湿热灭菌（高压蒸汽灭菌），在实验前应用 牛皮纸或干净的报纸包扎器皿。（2）酵母菌是真菌，对青霉素具有抵抗能力，青霉素主要抑 制细菌、放线菌的生长。（3）图中甲为安全阀，乙为放气阀，丙为压力表。（4）接种的平板上 未见菌落生长，说明接种不成功，原因可能是接种环灼烧后未冷却，使菌株因温度过高而 被杀死。答案：（1）干热灭菌和湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）用牛皮纸（报纸）包扎器皿（2）抑制细菌 （放线菌）的生长（4）接种环温度过高，菌种被杀死i重难点拨条件结果常用方法应用范围消毒较为 温和的物 理或化学 方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高

12、温的液体化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灭菌强烈的理化因素杀死物体 内外所有的微 生物，包括芽抱 和鞄子灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属用具高压蒸汽灭菌法培养基及容器全面比较消毒和灭命题点（三）微生物的培养与纯化4. （2017-江苏离考）苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明 同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解髙效菌株。请回答下列问题:活性污泥 當集培养10 i 10 2 10-3 10 4 10 5（1）酚降解菌富集培养基含有蛋白腺、k2hpo4、mgso4x苯酚和水，其中可作为碳源的有o（2）将采集到的样品接种培养，苯

13、酚用量应随转接次数增加而逐渐,以达到富 集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步,以便于菌落计 数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加 。(3) 右图为连续划线法示意图，在图中(填图中序号)区域更易获得单菌落。分别为(4) 采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量6 先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中15号比色管的苯酚浓度应解析:(1)富集培养基中蛋白腺、苯酚都是含碳的有机物，可作为碳源。(2)欲富集酚降 解菌，随转接次数的增加，应逐渐增加培养基中苯酚的含量；若接种培养后平板上菌落过 于密集，则应进一步稀释后再进行涂布，以降低平板上菌

14、落密度，便于菌落计数与分离； 平板培养基是固体培养基，除含有水、营养物质(碳源、氮源、无机盐等)外，还需添加琼脂 作为凝固剂。(3)利用连续划线法接种时，最后的划线区域()中，菌体的密度较小，容易获 得单菌落。(4)因系列浓度梯度中6号比色管中苯酚浓度为1 mg/l,故15号比色管中的 苯酚浓度应分别为0 mg/l、0.2 mg/l> 0.4 mg/l> 0.6 mg/l、0.8 mg/l;根据题意，废水为 50 mg/l苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于01 mg/l,需将残留液稀释20倍左右。答案：蛋白陈、苯酚(2)增加 稀释涂布 凝固剂(3)

15、(3) (4)0、0.2、04、06、0.8 5(2014全国卷u)为了调査某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细 菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：(1) 该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭 菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是:然后，将linl水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 ml稀释液；经适当培 养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为个。(2) 该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始

16、划线。这样做的目的是b（4）该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分 进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是： 振荡培养能提高培养液中的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高的利用率。解析：（1）为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取若干灭菌后的 空白平板先行培养一段时间。01 nil稀释液中平均有38个活菌，可推测每升水样中的活 菌数=38x10x100x1 000=3.8x1（r（个）。（2）接种环、接种针或其他金属用具直接在酒精 灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。在第二次及以后的划线时，总

17、是从上一 次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。（3）比较两图 可以看出，a是用平板划线法接种培养后得到的结果，b是用稀释涂布平板法接种培养后得 到的结果。（4）由于振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分 接触，提高营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。答案：检测培养基平板灭菌是否合格3.8 x107（2）灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落（3）b （4）溶解氧营养物质重难点拨平板划线法和稀释涂布平板法的比较比较项目平板划线法稀释涂布平板法关键操作接种环在固体平板培养基表面连续划线 一系列的梯度稀释 涂布平板

18、法操作注意事项每次划线前后均需灼烧接种环稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围菌体获取在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体从适宜稀释度的平板上的菌落 中挑取菌体适用范围适用于好氧菌适用于厌氧菌和兼性厌氧菌优点可以根据菌落的特点获得某种 微生物的单细胞菌落既可以获得单细胞菌落，又能对 微生物计数缺点不能对微生物计数操作复杂，需要涂布多个平板考点二微生物的筛选与计数命题点（一）土壤中分解尿素细菌的分离与计数1. （2017全国卷i）某些土壤细菌可将尿素分解成co?和nh3,供植物吸收和利用。回 答下列问题:（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生0能分解尿素的细菌

19、不能以尿素的分解产物 co2作为碳源，原因是 o但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内 的 葡 萄 糖 的 主 要 作 用 是 （答出两点即可）。（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择（填“尿素” “nh4no3”或“尿素+ nh4no3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是用来筛选分解尿素细菌的培养基含有kh2po4和na2hpo4，其作用有 （答出两点即可）。解析：（1）土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脉酶。尿素分解 菌是异养生物，不能利用co?来合成有机物，必须利用现成的有机物（如葡萄糖）作为碳源； 葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时

20、，葡萄糖还可以转化成 脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。（2） 选择培养基只是允许特定种类的微生物（目的微生物）生长，同时抑制或阻止其他种类微生物 生长的培养基。本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此配制的培养基应只允许尿素分 解菌生长，nh4no3可以作为所有细菌的氮源，培养基中如含有nh4no3,将不能起到筛选 作用。kh2po4和na2hpc）4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而hzpo/hpof可 作为缓冲剂，使培养基中ph保持相对稳定。答案:（1）br酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用co?来合成有机物 为细胞生 命活动提供能量，为

21、其他有机物的合成提供原料（2）尿素其他两组都含有nh4no3,能 分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用nh4no3,不能起到筛选作用（3）为细菌 生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中ph稳定2. （2016四川离考）图甲是从土壤中筛选产豚酶细菌的过程，图乙是脓酶基因转录的 mrna部分序列。逐级播:咎wk010 g细菌选择鉴别旨土壤样品焰养基培养基 甲培界基菌种cljgagugagaaanrtggu-271（衣示从起始密码开始算起的破川序号）乙图中选择培养基应以为唯一氮源；鉴别培养基还需添加作指示剂,产腺酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成色。(2) 在5

22、个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为1沪的土壤样品溶液0.1 ml,培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是,每克土壤样品中的细菌数量为xi炉个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较。(3) 现有一菌株的豚酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mrna在图乙箭头所示位置增加了 70个核昔酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有uag、uga和uaa)o突变基因转录的mrna中，终止密码为,突变基因表达的蛋白含个氨基酸。解析：(1)淼酶能够催化尿素分解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为 唯一氮源。挑取单菌落

23、接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周 围的氨增加，ph升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。 利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30300的平板，因此平板 上长出的细菌菌落平均数为(156+178+191)一3 = 175个。每克土壤样品中的细菌数为 175-0.1x1()5= .75x10*个。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释 涂布平板计数法的结果大。(3)箭头处插入70个核昔酸，箭头后密码子的解读方式为*ag, ug

24、a, gaa对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为ugao从起始密码到终止密码之前共有273 + 72个碱基，因此突变基因表达的蛋白质含115个氨基酸。答案：尿素酚红红(2)稀释涂布平板法1.75少(3)uga 115重难点拨统计菌落数目的两种方法(1)显微镜直接计数法:原理利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生 物的数量方法用计数板计数缺点不能区分死菌与活菌(2)间接计数法(活菌计数法):原当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中理的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌计算公每克样品中的菌株数=(c-v

25、)xm,其中，c代表某一稀释度下平板上生长的平 均菌落数，v代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml), m代表稀释倍数式贷设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择作菌落数在30300的平板进行计数命题点（二）分解纤维素的微生物的分离3（2014-全国卷i）植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题:（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖昔酶可将分解成（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（cr）时,cr可与纤维素形成色复合物。用含有cr的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的（3）为从

26、富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两 种培养基（成分见下表）：酵母膏无机盐淀 粉纤维素粉琼脂cr溶液7培养基甲+培养基乙+注：“ + ”表示有，“一”表示无。据表判断，培养基甲（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是;培养基乙（填“能”或"不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是o解析：（1）纤维素酶至少包括3种组分，即g酶、cx酶和葡萄糖昔酶，ci酶、cx酶催 化纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖昔酶将纤维二糖分解成葡萄糖。（2）cr能与培养基中的纤 维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，cr纤维素的复合物就无法形成，培养 基中会

27、出现以纤维素分解菌的菌落为中心的透明圈。（3）培养基甲中未添加琼脂，为液体培 养基，液体培养基上不能形成单菌落，故不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。培养基乙中 未添加纤维素，不能和cr形成红色复合物，即使出现单菌落也不能确定为纤维素分解菌。答案：（1）纤维二糖葡萄糖（2）红透明圈（3）不能液体培养基不能用于分离单菌 落不能培养基中没有纤维素，不会形成cr纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不 能确定其为纤维素分解菌重难点拨i微生物的筛选与鉴别方法(1)微生物的筛选方法:单菌落挑取法利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根 据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物选

28、择培养法利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物鉴定培养法利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生 物微生物的鉴别方法:菌落特征鉴别法根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别指不剂鉴别法如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微 生物能够分解尿素染色鉴别法如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈 来筛选分解纤维素的微生物演练提能精准化高效化真题集训验能力1. (2015-全国卷i)已知微生物a可以产生油脂，微生物b可以产生脂肪酶。脂肪酶和 油脂可用于生物柴油的生产。回答有

29、关问题：(1) 显微观察时，微生物a菌体中的油脂通常可用染色。微生物a产生的油脂不易挥发，可选用(填“萃取法”或“水蒸气蒸馅法”)从菌体中提取。(2) 为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物b的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以为碳源的固体培养基进行培养。(3) 若要测定培养液中微生物b的菌体数，可在显微镜下用直接计数;若要测定其活菌数量，可选用法进行计数。(4) 为了确定微生物b产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35 °c、40 °c、45 °c下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg,则上述三个温度中,

30、 °c条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕°c设计 后续实验。解析：(1)油脂可被苏丹iii染液染成橘黄色，被苏丹iv染液染成红色，因此油脂通常用苏丹iii或苏丹iv染色。不易挥发的物质大多采用萃取法进行提取，水蒸气蒸馅法一般用来 提取易挥发的物质。（2）能产生脂肪酶的微生物b能利用脂肪（油脂）作为碳源，所以在制备 选择微生物b的培养基时，应将油脂作为唯一的碳源。（3）用显微镜直接对微生物进行计数， 需要用血细胞计数板。如果对活菌进行计数，则要用稀释涂布平板法涂布平板，培养后统 计菌落数目，然后计算出活菌数量。（4）降解等量的油脂，需要的酶量越多，说明此

31、温度下 的酶的活力越小。所以三种温度中45 °c下酶的活力最小。从三种温度下的实验结果可知， 40 °c下酶的活力最大，所以要想测定该酶的最适温度，应围绕该温度设计不同温度梯度， 进行后续实验。答案:（1）苏丹ni（或苏丹iv）萃取法（2）油脂（3）血细胞计数板稀释涂布平板（4）45 402. （2015-江苏高考）人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高 秸秆的营养价值。为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其 降解纤维素能力进行了研究。请回答下列问题：（1）在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是（填序号）。酒精灯培养皿显微

32、镜无菌水（2）在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是（3）向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的 原因是（4）刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物 纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚果红培养基平板上，筛到 了几株有透明降解圈的菌落（见图）。图中降解圈大小与纤维素酶的有关。图中降解纤维素能力最强的菌株是（填图中序号）。（5）研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株鈣和血,在不同温度和ph条件下进行发酵,测得发酵液中酶活性的结果见下图，推测菌株更适合用于人工瘤胃发酵，理由是温度oc） p f: j 5 o o o o o o

33、 5 4 3 2 18 叫-protein)u g -pro-cin)解析：（1）在样品稀释和涂布平板过程中，需要在酒精灯火焰附近进行操作，培养皿用 于盛放培养基并培养细菌，无菌水做稀释的溶剂，此处唯一用不到的是显微镜。（2）在涂布平板时，要取少量菌悬液滴加到培养基表面，因为如果滴加菌悬液量过多，菌悬液就会堆 积在培养基表面，影响分离效果。(3)在向试管内分装含琼脂的培养基时，如果试管口粘附 有培养基，就很容易使棉塞受到污染，因此，需要用无菌的酒精棉球将试管口擦拭干净。 因为刚果红可以与纤维素形成红色复合物，且不与纤维素降解产物反应。所以在刚果红培 养基平板上，菌落周围有透明降解圈是纤维素被降

34、解的结果，降解圈大小由纤维素酶的活 性和量决定。图中菌落周围的降解圈最大，因此其降解纤维素的能力最强。(5)考虑到人 工瘤胃的发酵过程会使发酵液酸性增加，温度升高，在这个前提下，观察不同温度和ph条 件下测得的发酵液中酶活性的结果图，从图中可以看出，在高温和低ph条件下都是打菌 株中的纤维素酶的活性较高，因而该菌株更适合用于人工瘤胃发酵。答案：(1)(2)培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果(3) 避免培养基污染棉塞(4) 量与活性(5)j4发酵过程会产热和产酸，j4菌株在较高温度和酸性环境下酶 的活性更高3(2014-四川高考节选)有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污

35、染环境。研究发 现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。蛋白购滂液 甲划线纯化测定苯磺 隆降解率苯磺降溶液 乙匕淸液(1) 微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是(2) 纯化菌株时，通常使用的划线工具是o划线的某个平板培养后，第一划线 区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上 有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有解析：（1）微生物生长繁殖需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水和无机盐四类。根 据题意可知，土壤中某些微生物有降解苯磺隆

36、的能力，该实验的目的是探索其降解机制， 因此，需要分离出有降解苯磺隆能力的土壤中的某些微生物，故选择培养时为了排除其他 碳源的干扰，培养基中唯一碳源只能是苯磺隆。（2）纯化菌株时，通常使用的划线工具是无 菌接种环。据题意分析知，造成此现象的原因可能有两个：一是接种环灼烧后未冷却，菌 种接触到高温的接种环而死亡；二是划第二划线区域的第一条线时未从第一区域末端开始。（3）根据图乙所示实验中的上清液加入蛋白酶溶液推测，实验目的是探究目的菌株是否能分 泌降解苯磺隆的蛋白质，实验设计不合理之处是缺少不加蛋白酶溶液、其他条件同图乙的 空白对照。答案：（1）氮源和无机盐 只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁

37、殖（2）接种环 接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端开始（3）目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋 白质不合理，缺少空白对照4. （2013全国卷ii）临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从 病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的 敏感性。回答下列问题：（1）为了从样本中获取致病菌单菌落，可用法或法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。（2）取该单菌落适当稀释，用法接种于固体培养基表面，在37 °c培养箱中培养24h,使其均匀生长，布满平板。（3）为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有a、b、c、d四

38、种抗生素的滤 纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含a的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素a；含b的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素b含c的滤纸片周围的透明比含a的小，说明;含d的滤纸片周围的透明圈也比含a的小， 且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素d的（4）根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好选用抗生素。解析：（1）微生物的常用接种方法为平板划线法和稀释涂布平板法。（2）能够使菌落均匀 生长、布满平板的接种方法为稀释涂布平板法。（3）含a的滤纸片周围出现透明圈，说明该 致病菌对抗生素a敏感；含b的滤纸片周围没有出现透明圈，

39、说明该致病菌对抗生素b不 敏感；含c的滤纸片周围的透明圈比含a的小，说明该致病菌对c的敏感性比对a的弱； 含d的滤纸片周围的透明圈比含a的小，且透明圏中出现了一个菌落（排除杂菌污染），说 明该致病菌可能对抗生素d产生了抗药性。答案：（1）平板划线稀释涂布平板（或涂布）（2）涂布（3）敏感不敏感该致病菌对c的敏感性比对a的弱 耐药菌（4）a课下检测查缺漏|一、基础题点练1. 下列有关微生物培养的叙述，错误的是（）a. 测定土壤样品中的细菌数目，常用稀释涂布平板法进行菌落计数b. 在对微生物进行培养前，需要对微生物和培养基进行灭菌c. 酵母菌发酵过程产生的酒精，对其他微生物生长有一定的抑制作用d.

40、 分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源解析：选b 在对微生物进行培养前，需要对培养基进行灭菌，不能对所培养的微生 物进行灭菌。2. 做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是（）a. 高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖b. 倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上c. 为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落d. 用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上解析：选d 在高压灭菌的操作过程中，加热结束后应让灭菌锅内温度自然下降，待 压力表的指针指到零时，打开放气阀，旋松螺栓，打开盖子。倒平板时，用左手将培养皿 打开一条稍大于

41、瓶口的缝隙，而不是完全取下放到一边。接种环经火焰灼烧灭菌后应在火 焰旁冷却后，再用其挑取菌落。在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号 笔做标记。3. 下列关于统计菌落数目方法的叙述，错误的是（）a. 釆用平板计数法获得的菌落数往往少于实际的菌落数b. 当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落c. 为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数d. 在某一浓度下涂布三个平板，若三个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平 均值作为统计结果解析：选c 当两个或多个活菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统 计的菌落数往往比活菌的实际数目少。一般选择菌落数在30300的平

42、板计数，密度过大 会使计数结果偏小，影响结果的准确性。至少涂布3个平板，作为重复组，取其平均值计 数能增强实验的说服力和准确性。4在涂布有大肠杆菌的培养基上进行抑菌实验，在a、b、c处分别贴 浸有不同抗生素（浓度相同）的无菌滤纸片，d处滤纸片浸有无菌水。培养 后的结果如图所示。以下判断错误的是（）a. a处抑菌效果小于b处b. b处的滤纸片没有沥干c. c处抗生素无效d. d为对照解析：选a 培养皿中不同滤纸片四周透明圈的大小不同，透明圈越大，说明浸有的 抗生素抑菌效果越好。a处的透明圈大于b处；b处不是圆形的透明圈，可能是滤纸片没有 沥干，抗生素流出滤纸片；c处无透明圈，说明c处抗生素对大肠

43、杆菌无效；d为空白对照。5. (2016-江苏离考)漆酶属于木质素降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。如图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是(多选)()a.生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品b.筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落c. 在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化d. 斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株解析：选bc 生活污水中含木质素的物质相对较少，产漆酶菌株也较少，不宜作为分 离产漆酶菌株的样品；产漆酶菌株可降解木质素，在筛选培养基中加入木质素可筛选产漆 酶的菌株，筛选时可通过菌落特征挑出

44、产漆酶的菌落；在涂布平板上生长的菌落可能还有 其他杂菌，可再通过平板划线法进一步纯化；对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管 藏的方法，即在一2u°c的冷冻箱中保存。二、高考题型练6. 回答与微生物实验室培养有关的问题：(1) 在制备固体培养基时需加入的常用凝固剂是o若培养基需调节ph,则应在灭菌之(填“前”或“后”)调节。(2) 为防止外来杂菌入侵，对等可采用干热灭菌法进行灭菌。(3) 右图为平板划线法接种后的示意图。在划线接种的整个操作过程中，对接种环至少需进行次灼烧灭菌。接种后盖上皿盖，将平板放入恒温箱中培养，这样放置的目的是o(4) 用稀释涂布平板法统计活菌数目时，每隔一个“

45、时间间隔”统计一次菌落数目，最后选取作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏菌落的数目。解析：（1）制备固体培养基通常加入的凝固剂是琼脂。培养基若在灭菌后调ph,可造成 污染，故培养基调ph应在灭菌前进行。（2）灭菌的方法通常有高压蒸汽灭菌、干热灭菌和 灼烧灭菌三种。采用干热灭菌的通常有玻璃器皿和金属用具。（3）平板划线接种过程中需在 接种前、每次划线后对接种环进行灼烧灭菌。图中共接种5个区域，故接种环至少需要进 行6次灼烧灭菌处理。微生物培养过程中，易产生冷凝水，为防止水珠滴在培养基表面造 成污染，培养时需将平板倒置。（4）用稀释涂布平板法统计活菌数目时，要以菌落数目稳定 时的记录为最终结

46、果，这样可以防止因遗漏而导致统计结果偏小。答案：（1）琼脂前（2）玻璃器皿和金属用具（3）6倒置避免培养基被污染和防止 培养基水分过快挥发（4）菌落数目稳定时的记录7. （2018-郴州质检）分解尿素的微生物广泛存在于农田等土壤中，某生物实验小组尝试 对分解尿素的微生物进行分离与计数。请回答下列问题：（1）分解尿素的微生物能产生酶;配制培养基时应以作为唯一氮源。（2）培养基中添加作为指示剂，培养后，培养基ph会（填“升高”或“降低”），可使指示剂变红色。（3）对尿素溶液进行灭菌的最适方法是。（4）该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是 >然后将iml样液

47、稀释10 000倍，在3个平板上用涂布法分别涂布0.1 ml稀释液；经 适当培养后，3个平板的菌落数分别为39、42和45。据此可得出每毫升样液中分解尿素的 微生物活菌数为个。解析：（1）分解尿素的微生物能产生豚酶；配制培养基时应以尿素作为唯一氮源。（2）在 细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的豚酶分解尿素可产生氨，氨会使培养基的ph升高， 进而使酚红指示剂变红。（3）对尿素溶液进行灭菌的最适方法是过滤法。（4）在接种前，随机 取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，其目的是检测培养基平板灭菌是否合格。每毫 升样液中分解尿素的微生物活菌数=（c*v）xm = （39 + 42 + 45）-3-0

48、.1 x10 000 = 4.2x106（个）答案：（1）豚尿素（2）酚红升高（3）过滤法（4）检测培养基平板灭菌是否合格4.2 x 1068. （2018 林调研）有机磷农药是用于防治植物病虫害的含磷有机化合物，广泛应用于 农业生产中，有时会造成瓜果蔬菜等食品农药残留超标，不少品种对人、畜的毒性很强， 人误食后如不及时医治就会危及生命，某班同学欲从土壤中分离高效降解有机磷农药的微 生物。请回答下列问题：（1）为了获得能降解有机磷农药的微生物菌种，可在被有机磷农药污染的土壤中取样，并在含有碳源、氮源及等的选择培养基上添加进行选择培养。(2) 将获得的3种待选微生物菌种甲、乙、丙分别接种在1 l

49、含20 mg有机磷农药的相同培养液中培养(培养液中其他营养物质充裕、条件适宜)，观察实验开始到微生物停止生长所用的时间，甲、乙、丙分别为32小时、45小时、16小时，则应选择微生物(填“甲” “乙”或“丙”)作为菌种进行后续培养，理由是制备固体培养基的基本步骤是计算一一溶化分装一加棉塞一包扎-倒平板。(4)若要测定培养液中选定菌种的菌体数，既可在显微镜下用直接计数,也可选用法统计活菌数目。解析：(1)微生物生长所需要的营养一般包括水、无机盐、碳源和氮源。因筛选能降解 有机磷农药的微生物，故培养基中需添加适量的有机磷农药。(2)从观察实验开始到微生物 停止生长，丙所用时间最短，说明其对有机磷农药

50、的降解能力较甲、乙强。(3)制备固体培 养基的基本步骤是计算-称量溶化-分装-加棉塞包扎高压蒸汽灭菌倒平板。(4) 菌体数测定可通过显微镜利用血细胞计数板直接计数，也可以利用稀释涂布平板法统计活 菌数量。答案：(1)水和无机盐 有机磷农药(2) 丙 微生物丙分解有机磷农药的能力比甲、乙强(3) 称量高压蒸汽灭菌(4) 血细胞计数板稀释涂布平板9. (2018-河南六市联考)微生物强化采油(meor)是利用某些微生物能降解石油，增大 石油的乳化度，降低石油黏度的原理，通过向油井中注入含微生物的水来提高釆油率的新 技术。以下是人们筛选、纯化和扩大培养该类微生物的实验操作。请回答下列问题：(1) 土

51、壤是微生物的大本营，该类微生物应取自的土壤。(2) 为筛选和纯化该类微生物，从功能上分，应选用培养基。常用的接种方法是和。(3) 接种后，应密封培养的原因是培养一段时间后在培养基上形成降油圈，此时选取就可获得高效菌株。(4) 扩大培养过程中需要对微生物进行计数。取02 nil样品，用固体培养基对其培养,最后统计三个平板,菌落数分别是200、180、220。则样品中微生物的数量为个/ml。该统计结果(填“低于”或“高于”)实际值。解析：(1)在长期被石油污染的土壤中生存下来的微生物，能降解石油，所以取样时应 从含石油多的土壤中釆集。(2)从功能上分，应选用特定的选择培养基进行筛选和纯化该类 微生

52、物；常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(3)该类微生物是厌氧微生物，接种后应密封培养；培养一段时间后在培养基上可形成降油圏，降油圏越大，说明该处的 微生物降解石油的能力越强，所以应选择降油圈大的菌落进行培养以获得高效菌株。（4）计 算微生物的数量应取三个平板的平均值，即（200+180+220）-3-0.2=1 000（个/ml）,该结 果会低于实际值，因为当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落数。答案：（1）长期被石油污染（含石油多的）（2）选择平板划线法稀释涂布平板法（3）该类微生物是厌氧型的降油圈大的菌落（4）1 000 低于10欲从腐乳中分离筛选出产蛋白酶活力

53、高的毛霉菌株，设计了如下实验流程: 挑取腐乳样品上的菌丝，制成抱子悬浮液 涂布于孟加拉红培养基，进行分离 取菌落接种丁酪蛋白培养基，进行筛选 测定蛋白酶活力回答下列问题：毛霉属于（填“真核”或“原核”）生物。在腐乳制作中，主要利用毛霉等微生物产生的酶将豆腐中的蛋白质和脂肪分解为小分子物质o（2）步骤进行涂布前，需将抱子悬浮液进行梯度稀释，进行梯度稀释的目的是。若进行10倍稀释，一般吸取lml悬浮液注入中，混匀。（3）孟加拉红培养基常用于分离霉菌及酵母菌，在孟加拉红培养基中加入氯霉素可以抑制细菌的生长。从功能上看，孟加拉红培养基属于培养基。（4）毛霉产生的酶能将酪蛋白分解而产生透明圈，在酪蛋白培养基中筛选到三个单菌落甲、乙、丙，其菌落直径分别为3.2 cm. 2.8 cm. 2.9 cm,其菌落与透明圈一起的直径分别 为3.7 cm、3.5 cm. 33 cm。应选择菌落作为产蛋白酶活力高的毛霉候选菌。解析：（1）毛霉属于真核生物。在腐乳制作中，主要利用毛霉等微生物产生的蛋白酶和 脂肪酶