白腐真菌琥珀骤木耳对稻草秸秆的降解研究

1、学科分类号0818本科生毕业论文（设计）题目（中文h 白腐真菌琥珀骤木耳对稻草秸秆的降解研究（英文）：the research of white rotting fungi amber fungus degradation of the straw学生姓名：李健强学号：0712401025系另ij:生命科学专业：生物工程指导教师：刘胜贵 教授邹娟 讲师起止日期：2010.3-2011.5怀化学院本科毕业论文（设计）诚信声明作者郑重声明：所呈交的本科毕业论文（设计），是在指 导老师的指导下，独立进行研究所取得的成果，成果不存在 知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，论文不含任 何其他个人或集

2、体已经发表或撰写过的成果。对论文的研究 做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确的方式标明。 本声明的法律结果由作者承担。本科毕业论文（设计）作者签名:目录鯉i姗同iabstract iikey words ii1.1 前言11.2半纤维素、纤维素、木质素结构11.3 白腐真菌对木质素的降解31.4 白腐真菌锁状联合42 材料与方法400 材料与设备5实验材料5实验药品5仪器设备5培养基6实验药剂62.1.61mg/ml的葡萄糖标准液配制611 实验方法72.2.1菌种活化72.2.2白腐真菌琥珀骤木耳的菌落观察7锁状联合观察7葡萄糖标准曲线制作72.2.5稻草秸秆的固体发酵82.2.6半纤维

3、素、纤维素、木质素的测定93结果与分析103.1锁状联合观察103.2白腐真菌琥珀骤木耳菌落观察113.3葡萄糖标准曲线的绘制113.4半纤维素、纤维素、木质素的含量12123.4.1半纤维素含量纤维素含量16木质素含量194 组仑22参考文献23至燃24白腐真菌琥珀骤木耳对稻草桔秆的降解研究摘要为了了解白腐真菌？对半纤维素、纤维素、木质素的降解能力，本文使用 了固态发酵的方法，测定了在不同培养条件下该菌种对稻草秸秆粉中的半纤维 素、纤维素和木质素的降解能力。并通过制作葡萄糖标准曲线和实验所测得的 od值，从而得知白腐真菌在四组不同温度(26°c，28°c, 30°

4、;c, 32°c)和四组 不同的ph (2.5,3.5,4.5,5.5)下固态发酵，在温度为28°c、ph为3.5时，其半纤 维素降解率迗到23.60%，纤维素降解率迗到15.24%,木质素降解率迗到43.49%o 这是该菌种对稻草秸秤降解效果最好的条件。关键词白腐真菌；稻草秸秆；木质素；纤维素；半纤维素；降解the research of the white rotting fungi amber fungus5s degradation of the strawabstractcrop straw is a by-product of agricultural prod

5、uction, and is also an important biological; resources. the specialty of its structure makes it hard to break down which leads the conversion become difficult. this article is about the sedimentary endoscope of the white rotting fungi amber fungus hypha .which aims to comprehend its clamp connection

6、 structure .and also it tests the degradation of the plant stovers hemicellulose,cellulose and lignin in the different education conditions. the od value which have got by making the glucose standard curve and the experiment. we know that under the four different temperate (26 °c ,28 °c ,3

7、0 °c ,32 °c) ，ph value (2.5,3.5,4.5,5.5) and solid fermentation，the result indicates that preferable result of straws degradation is procured when the conditions are 30°c temperate and ph value 3.5.in this condition，the degradation ratio of hemicellulose were 23.60%,the cellulose were

8、 15.24% and the lignin were 43.49%.key wordswhite rotting fungi; straw; lignin; cellulose; hemicellulose; degradation1.1前言农作物秸秆作为一种可再生资源，在我国具有分布广、数量大、 种类多、价格低廉的特点。如何充分利用这些资源而又使环境不受污 染，是现代农业面临的难题1。农作物秸秆主要由纤维素、半纤维素 和木质素三大组分组成，由于纤维素特别是木质素难以被分解，影响 其利用推广。近几十年来，国内外科研人员虽然研究了一些物理、化 学的秸秆利用方法，但都存在着利用不充分、成本高等问

9、题23。实践 表明，秸秆的生物法利用是最佳途径，此法具有降解率高，安全环保, 成本低等优点。国内外近年来就如何提高白腐菌木质素降解酶的产量做了大量 工作4，但过去的研究主要集中于白腐菌的液体培养、产酶条件的优 化选择及该菌去除废液中木质素的工艺控制5，对于白腐菌固态发酵 情况下降解固态木质素的研究较少。所以，科学合理地探寻白腐菌固 态发酵的最佳条件并利用其处理固态木质素具有一定意义。1.2半纤维素、纤维素、木质素结构禾本科植物秸秆的半纤维素结构主要是聚木糖，即聚阿拉伯糖基 -4-0-甲基葡萄糖醛酸木糖，其典型分子是以1-4j3苷键连接的d-咄喃 型木糖基为主链，在主链的c_3和c_2上分别连有

10、l-呋喃型阿拉伯糖基 和d-吡喃型葡萄糖酸基作为支链。图1是麦草秸秆中的半纤维素结 构。图1从压力精磨的小麦秸秆中分离的半纤维素的假设结构fig.l a tentative chemical structure of hemicellulose b extracted from pressure-refined wheat straw纤维素则是由若干个p一葡萄糖构成的，葡萄糖单元之间以 p一1,4苷键结合而形成的长链大分子物质，分了不分支。图1.2纤维素分子中p葡萄糖的结合纤维素是由许多葡萄糖分子单元连接而成的高分子化合物，其葡萄糖以p1,4苷键型缩合而成的。此外，他们彼此以氢键相连，尽 管氢

11、键的键能比一般的化学键能小得多，但因氢键的数目多，这些氢 键构成巨大的氢键网格，直接导致了致密的晶体结构的形成。致密的 晶体结构严重阻碍了化学试剂或者生物酶与纤维素表面的有效接触 和作用，这也正是天然纤维素非常难于水解的重要原因。木质素分子中不像纤维素那样有单一结合形式，化学结构非常复 杂。一般认为木质素的基本结构单元是苯丙烷，共有3种基本结构:愈创木基丙烷、紫丁香基丙烷和对羟苯基丙烷，如下图1.3所示。ce-cc-cc愈创木基结构紫丁香基结构对羟苯基结构图1.3木质素的三种基本结构单元fig 1.3 three basic structural units of lignin这些结构单元之间

12、通过醚键和c一c键连接在一起形成具有三维 体型结构的天然酚类无规聚合物。1.3白腐真菌对木质素的降解在木质素的自然降解中，降解能力最强的是白腐菌，此外还有褐 腐菌、软腐菌以及细菌。白腐菌为丝状真菌，因腐生在木材上引起木 材的白色腐朽而得名。白腐菌对木质素的降解主要通过三种酶来完 成：木质素过氧化物酶(lignin peroxidase, lip)、猛过氧化物酶 (manganese-dependentperoxidase, mnp)、漆酶(laccase，lac) o 迄今 为止，利用lip，mnp和漆酶作用木质素仍是木质素降解的最主要手 段。lip是一系列含fe、卟啉环和血红素附基的同工酶，

13、能以h2o2 为电子受体氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化合物。电子传递体攻 击木质素时，它能从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子，将其氧化 成自由基，然后以链式反应产生许多不同的自由基，导致木质素分子 中主要键断裂。mnp也是血红素过氧化物酶，能够氧化酚型木质素，mnp在h2o2的启动下，氧化mn24为mi?+，然后后者进一步氧化各 种酚型化合物。漆酶是最早被发现的木质素降解酶，大多分布在担子 菌(basidimycetes)，多孔菌(polyporus),柄抱壳菌(podospora)等中。漆酶是以02为电子受体的含铜单电子氧化酶。其作用是使固体木质 素的羧基增加而成为水溶性的状态，易于接受后

14、续酶的作用，漆酶同 时还有解聚木质素的作用。白腐真菌能够选择性降解木质素、纤维素和半纤维素，其降解能 力因相关影响因素而异。本文通过对白腐真菌琥珀骤木耳的研究和它 对稻草秸秆中木质素、纤维素、半纤维的降解实验，找到它最适合降 解稻草桔秆的温度、ph等，从而充分发挥其作用，使其对降解半纤 维素、纤维素、木质素等方面提供一定的理论依据。1.4白腐真菌锁状联合担子菌的次生菌丝每一个细胞都有二个核，其中一个核来自母 本，一个来自父本，当双核细胞进行细胞分裂时，在二个核之间 处生一个短小弯曲的分枝，核移动，一个核进入钩，一个留在菌 丝。两个核分裂后，钩中保留一个核，菌丝中二个核一往前一个 往后移，钩状突

15、起向下弯曲与细胞壁接触溶化，分枝基部生分隔 膜(分隔中间有孔道)，在原分支外形成一隔膜，产生一个新细胞 双核体，在分隔处保留一个桥形结构称锁状联合。锁状联合的意 义：保证每个菌丝细胞内都含有两个不同性别的核。为进行有性 生殖，通过核配形成担子打下基础。2材料和方法2.1材料与设备2.1.1实验材料实验菌种：白腐真菌琥珀骤木耳稻草：来自五楼微生物实验室2.1.2实验药品磷酸二氢钾（天津市石英钟厂霸州市化工分厂）、无水乙醇（分 析纯、湖南汇虹试剂有限公司）、磷酸氢二纳（分析纯，天津石英钟 厂霸州市化工分厂）、氢氧化纳（分析纯，广东汕头市西垅化工厂）、 氯化钠（分析纯，成都市金山化工试剂厂）、硫酸镁

16、（分析纯，广东 汕头市西拢化工厂）、丙酮（分析纯，湖南汇虹试剂有限公司）、琼脂 粉（生化试剂，湖南汇虹试剂有限公司）。2.1.3仪器设备zhwy211b卧式恒温震荡摇床、sigma3k-18型离心机（德国 sigma公司生产）、qyq-1000-ul/qyq-200-ul移液枪（北京青云航空仪表有限公司生产）、cj型水平层流净化工作台（苏州洁净技术 研究所制造）、sl-phs-3e酸度计、mci5-9x2-12电炉、海尔 bcd-215ka冰箱、fa2004电子天平、752型紫外可见分光光度计（上 海光谱仪器有限公司）、yxq-ls-50si立式压力蒸汽灭菌锅（上海博 迅实业有限公司医疗设备厂

17、）、sw-420-2s恒温水浴锅（金坛市新航 仪器厂）、csioi-ie（b）电热鼓风干燥箱（中外合资重庆四迗实验仪器 有限公司）、dhp-2000电热恒温培养箱、马福炉、粉碎机、接种铲、 培养皿等。2.1.4培养基pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，水1000ml，自然ph。固态发酵营养液葡萄糖lo.og，酒石酸钾钠(c4h4o6knarh2o) 2mmol，吐温20 2.0g,醋酸缓冲液10mmol(ph5.0)，磷酸二氢钟3.0g， vbmg；微量元素组合液：硫酸镁(mgsor7h2o) 1.5g，硫酸亚铁 (feso4.7h2o)0.2g，硫酸锰(mnso4.h2o

18、)0.2g，硫酸铜(cuso4.5h2o) 15 mg,无水氯化鈣0.4g，愈创木鼢l.og，自来水loooml，备用。取 四分已经配好的固态发酵营养液50ml，用0.1m的naoh和0.1m的 hc1来调节ph值，调节四组不同ph值：ph值2.5、ph值3.5、ph值4.5、ph值5.5的营养液。然后121°c，20min灭菌备用 2.1.5实验药剂中性洗涤剂的配置：称取18.6gedta、6.8gna2b4o7放入烧杯中， 加入少量蒸馏水，加热溶解后，再加入30gsds和10ml乙二醇乙醚。 再称取4.56g无水na2hpo4置于另一烧杯中，加入少量蒸馏水微微加 热溶解后，倒入前

19、一个烧杯中，在容量瓶中稀释定容至1000ml，其 中 ph 值约为 6.9-7.1。72m盐酸溶液：167ml浓盐酸(比重1.19)用蒸馏水定容至1000ml o72%浓硫酸溶液：665mlh2so4(比重1.84)加入300ml水中，冷 至20°c,补加水至1000mlo2.1.6 lmg/ml的葡萄糖标准液。将葡萄糖在恒温干燥箱中105°c下干燥至恒重，准确称取loomg于100ml小烧杯中，用少量蒸榴水溶解 后，移入100ml容量瓶中用蒸馏水定容至100ml，充分混匀。4°c冰 箱中保存备用。2.2试验方法2.2.1种活化(1) 配制pda培养基100ml，

20、装入250ml锥形瓶中，和培养皿 一起于121°c灭菌20min。(2) 灭完菌后，趁热，在超净工作台上倒5个pda平板。(3) 等平板冷却后，用接种铲在保存有菌种的试管斜面铲取少 许菌种，接种到pda平板中央，然后把接种后的平板置于28°c的恒 温培养箱中培养。2.2.2白腐真菌琥珀骤木耳的菌落观察一周后，从恒温培养箱中取出培养皿，观察该菌在pda平板上 的生长情况。如该菌落的大小、形状、颜色、光滑程度等等。2.2.3锁状联合观察染色镜检。在超净工作台上采用无菌操作，在载玻片上加一滴乳 酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从真菌菌落边缘处挑取已产孢子的真 菌菌丝，先置于50%乙醇

21、中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片 上的染液中，用解剖针小心的将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜 下观察，然后换高倍镜观察。2.2.4葡萄糖标准曲线制作用dns法，在波长为540nm条件下，测定一系列已知样品，制备标准glc曲线。表2.1葡萄糖标准曲线的制作table 2.1 facture of normal curve of glucose管号1 mg/ml葡萄糖标准液/ml蒸馏水/mldns/ml葡萄糖含量/mg10.02.01.50.020.21.81.50.230.41.61.50.440.61.41.50.650.81.21.50.861.01.01.51.0取6支25ml具塞

22、刻度试管编号，按上表加入浓度为lmg/ml葡 萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(dns)，配成不同葡萄糖 含量的反应液。将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，放 入水中冷却至室温，用蒸馏水定容至25ml,混匀，在分光光度计上 进行比色。波长540nm，用1号管样品调零点，测出光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，作标准曲线。82.2.5稻草秸秆的固体发酵粉碎。将稻草秸秆于80qc干燥箱中干燥，然后用粉碎机粉 碎，用60目筛子过筛。稻草粉灭菌。取8个250ml的锥形瓶，每个锥形瓶内加入稻草粉4g，然后1210c，灭菌20min。接种发酵。在无菌工作台上，用移液

23、枪往四个锥形瓶中加入5mlph自然的固体发酵培养基，另外四个锥形瓶分别加入ph为2.5、3.5、4.5、5.5的固体发酵培养基。分别接种三个菌片，贴上标 签。然后分别于26°c，28°c，30°c，32°c的恒温培养箱中放上ph自 然的固体培养基锥形瓶培养，其余4个ph不同的锥形瓶置于28°c的 恒温培养箱中培养。2.2.6半纤维素、纤维素、木质素的测定5天后，在无菌条件下，分别称取发酵的稻草秸秆粉0.5g， 至于150ml的锥形瓶中，加入20ml中性洗漆剂，100°c保温lh，过 滤，残渣用水、丙酮洗。滤液弃去，残渣备用。半纤维素含

24、量测定9d2将上述残渣置于150ml锥形瓶中， 加入20ml2m盐酸溶液，100qc保温50min，过滤，水洗残渣至 ph6.5-7.5。取9支洗净烘干的25ml具塞刻度试管，编号后在1号试 管中加入2ml蒸馏水作为空白对照。在另外8支试管中分别加入2ml 不同温度、不同ph的滤液，再向每支试管中各加入1.5mldns溶液， 充分摇匀后沸水浴5min,取出冷却后用蒸榴水定容至25ml,充分混 匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定其他8 支试管的光密度值(od值)并记录结果，对照葡萄糖标准曲线从而 得到还原糖含量，乘上系数0.9得到半纤维素含量。纤维素含量测定：将第三步制备

25、的残渣用丙酮洗两次，60°c 干燥，加入5ml致冷的72%硫酸,20°c水解3h后加入45ml蒸馏水, 室温过夜，次日用蒸馏水洗残渣至ph6.5。取9支洗净烘干的25ml具 塞刻度试管，编号后在1号试管中加入2ml蒸馏水作为空白对照。在 另外8支试管中分别加入2ml不同温度、不同ph的滤液，再向每支 试管中各加入1.5ml dns溶液，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却 后用蒸馏水定容至25ml，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调 零点，在540nm波长下测定其他8支试管的光密度值（0d值）并记 录结果，对照葡萄糖标准曲线从而得到还原糖含量，乘上系数0.9得 纤维素含量。

26、（4）木质素含量测定：将第四步残渣于80°c烘干，称重（w） 后在550°c灰化，得灰分（wd，木质素含量=w-wi。（5）每隔5天取一次样，重复以上步骤，总共取6次样。3结果与分析3.1锁状联合观察把用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色的菌丝用显微镱观察，下面是其锁状联合结构图3.1白腐真菌的锁状联合结构(10x40)figure 3.1 the lock of white rot fungi joint structure (10x40)通过该菌种的锁状联合的观察，确定了该菌种为担子菌。3.2白腐真菌琥珀骤木耳菌落观察菌种活化一周后，观察该菌种形成的菌落，其菌落图片如下:图3.2

27、白腐真菌菌落图片figure 32 pictures of white rot fungus colony 经过观察发现，该菌种形成的菌落直径有2-3厘米，为白色绒毛状，向四周生长，挑取菌种时发现不易挑取。3.3葡萄糖标准曲线的绘制于540nm波长下，以空白对照调零点后测得其各管溶液的光密度值并记录结果如下表3.1所示。根据表3.1数据，以葡萄糖含量(mg) 为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，使用origin作图软件在坐标 纸上绘制出葡萄糖标准曲线图3.1。其中，葡萄糖量由公式y=0.5308x-0.0086,推出 x=(y+0.0086)/0.5308, x 即为葡萄糖量，单位(mg)表3

28、. l葡萄糖标准曲线测定结果table 3.1 determination results ot standard curve of glucose管号空白i2345葡萄糖含量（mg）00.20.40.60.81.0光密度(od540nm)00.1480.3650.5500.7230.8710.00.20.40.60.8葡萄糖含显/mg图3. 3葡萄糖标准曲线 fig 3.3 standard curve of glucose1.0.0.8 1.0.6 4 2 0 o o o o os §/迴呆彭3.4半纤维素、纤维素、木质素含量3.4.1在不同时期半纤维素的含量变化（）在温度为26

29、°c，28°c，30°c，32°c时，经过固体发酵后，稻草拮 秆粉里面半纤维素含量变化如下：表3.2半纤维素含量（）与温度关系表tabic 3.2 hcmiccllulosc content and temperature relationship table温度0天5天10天15天20天25天30天26°c18.5218.2616.5415.7515.3514.8214.5628°c18.5218.0516.2315.4515.0614.6114.3330°c18.5218.1916.4515.6415.2114.7514

30、.4832°c18.5218.3416.7615.8915.5215.0214.81半纤维素含量（）与温度的关系-<-26°c 28oc 30 °c 32°c图3.4半纤维素含量()与温度关系图figure 3.4 hemicellulose content (%) versus temperature在ph为2.5，3.5, 4.5，5.5时，经过固体发酵后，稻草秸秆粉里 面半纤维素含量变化如下：表3.3半纤维素含量（）与ph关系表table 3.2 hemicellulose content (%) and temperature relati

31、onship tableph0天5天10天15天20天25天30天ph2.518.5218.0216.6515.6815.1514.8714.61ph3.518.5217.8516.0515.3514.8514.4514.15ph4.518.5217.9516.1515.4615.0114.5614.28ph5.518.5218.0516.2515.5615.8215.0714.45半纤维素含量（）与ph关系图ph2. 5 ph3. 5 ph4. 5 ph5. 50天 5天10天15天20天25天30天时间图3.5半纤维素含量变化()与ph关系图figure 3.5 hemicellulose

32、 content (%) and ph diagram3.4.2在不同时期纤维素的含量（）在温度为26°c，28°c, 30°c, 32°c时，经过固体发酵后，稻草拮 秆粉里面纤维素含量变化如下：表3.4半纤维素含量（）与温度关系表table 3.4 hemicellulose content （%） and temperature relationship table温度0天5天10天15天20天25天30天26°c30.8530.4628.4127.7427.3626.9826.7528 °c30.8530.3328.1527.5

33、27.0226.6526.3130°c30.8530.428.3527.6527.2626.8526.5532°c30.8530.5628.5828.0227.627.2126.95纤维素含量（）与时间关系图-<-26°c 28oc 30 °c 32°c5天 10天15天20天25天30天 时间图3.6纤维素含量变化()与温度关系阁figure 3.6 cellulose content (%) versus temperature在ph为2.5, 3.5, 4.5，5.5时，经过固体发酵后，稻草拮秆粉里 面纤维素含量变化如下表：表3.5

34、半纤维素含量()与ph关系表table 3.5 hemicellulose content (%) and ph relationship tableph0大5大10大15大20大25大30大ph2.530.8530.7528.4627.7127.2126.9226.65ph3.530.8530.3028.0527.3526.8326.5526.15ph4.530.8530.4528.1527.4127.0026.6526.25ph5.530.8530.5528.3327.5127.1826.8426.38纤维素含量（）与温度关系图zo ph2. 5 -«-ph3. 5 ph4. 5

35、 + ph5. 50天 5天10天15天20天25天30天时间图3. 7纤维素含u变化()与ph关系阁figure 3.7 cellulose content (%) and ph diagram3.4.3在不同时期木质素的含量（）在温度为26°c，28°c, 30°c, 32°c时，经过固体发酵后，稻草秸 秆粉里面木质素含量变化如下表：表3.6木质素含量()与温度关系表table 3.6 lignin content (o/o) and temperature relationship table温度0天5天10天15天20天25天30天26 

36、6;c20. 5819. 6516.6114. 4513. 3012. 7512. 4628 °c20.5819. 6016.4214.2213.0112.2311.8230 °c20. 5819.6216. 5514. 3213. 1012.5012. 3332 °c20.5819.7716.7214.6013.4212.8812.65木质素含量（）与温度关系乙丄()酬釦账w长26oc 28oc 30 °c 32°c0天 5天10天15天20天25天30天时间阁3.8木质素含量变化()与温度关系阁figure 3.8 lignin conte

37、nt (%) versus temperature在ph为2.5, 3.5, 4.5，5.5时，经过固体发酵后，稻草拮秆粉里 面木质素含量变化如下表：ph0天5天io天15天20天25天30天ph2.520.5819.8816.8814.6813.3212.4412.01ph3.520.5819.4816.3014.1012.8512.0011.43ph4.520.5819.5616.4814.2513.0012.1511.65ph5.520.5819.7016.6114.4613.1512.3111.74木质素含量（）与ph关系u 9 11 ph2. 5 ph3. 5 ph4. 5 ph5. 513120天 5天10天15天20天25天30天时间图3.9木质素含量变化()与ph关系图figure 3.9