热痹清颗粒的质量标准提升研究

1、热痹清颗粒的质量标准提升研究孙晓静杨柳李力解小霞李婷武汉市中医医院国家中医药管理局中药制剂三级实验室摘要：目的:建立热痹清颗粒的质量标准。方法:采用薄层色谱法(tlc)对热痹清颗粒 中知母、赤芍、忍冬藤、车前草进行定性鉴别;采用反向高效液相色谱法对热痹 清颗粒中马钱苗、3药苗进行含量测定，色谱枯为wondasil c18 (4. 6111111x2sonini,5 pm),流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱，流速为l.omlinin1，检测 波长为236nni (马钱苻)、230nm (芍药苷)，柱温为30°c。结果:tlc斑点清晰， 分离度良好，阴性对照无干扰;马钱苷、芍药苻

2、分别在各自进样量范围内与峰面 积呈良好线性关系，相关系数均在0.999 9以上，平均加样回收率分别为 100.04%、98.35%, rsd分别为1.46、1.64 (n=6) 0结论：该方法快速、准确、 专属性强，可作为热痹清颗粒质量控制的方法。关键词：热痹清颗粒;质量标准;马钱苷;芍药苷;芒果苷;大车前苷;作者简介：孙晓静，女，硕士研允生，主管中药师，主要从事中药制剂研允工作; 电话e-mail: jing_228sina. com作者简介：杨柳，女，硕士研究生，主管中药师，主要从事中药制剂研究工作； 电话e-mail:4895425

3、3qq. com收稿日期：2017-07-18基金：基金项目：武汉市中青年医学骨干人才培养工程(武卫生计生通20159 号)improvement of quality standard of rebiqing granulessun xiao-jing yang liu li li xie xiao-xia li tingwuhanho suit al o ftrad i t i onal ch ines e medicine,traditional chinese medicine pharmaceuticallaboratory of state administration oftra

4、ditional chinese medicine;abstract：objective to establish the quality standard for rcbiqing granules. methods tlc was adopted to identify rhizoma anemarrhenae, red peony, honeysuckle and plantain. contents of loganin, paeoniflorin in rebiqing granules were determined by rp-hplc. wondasil c18 (4. 6 m

5、mx 250 mm, 5 u m) was the analytical column. the mobile phase was acetonitri 1e"0. 2% phosphoric acid aqueous solution for gradient elution, at a flow rate of 1. 0 ml min'1, detection wavelengths of 236 nm (loganin) and 230 nm (paeoniflorin) . the column temperature was 30 °c. results

6、tlc spots were clear and well separated without negative interference. the calibration curves of loganin and paeoniflorin were in good linearity. the average recovery rates were 100. 04% and 98. 35%, rsd 1. 46 and 1. 64 (n=6). conclusion the method is fast, accurate and has good specificity and can

7、be used for quality control of rebiqing granules.keyword：rebiqing granules; quality standard; loganin; paeoniflorin; mangiferin; plantamajoside;received： 2017-07-18热痹清颗粒（鄂药制字z20112095）为武汉市中咲咲院现有咲院制剂，由生石 膏、知母、赤芍、全蝎、忍冬藤、车前草、土茯苓、薏苡仁、甘草九味中药组成。 该方经过临床验证，疗效确切，质量稳定，口碑较好。其具冇清热利湿，通络止 痛的功效，临床上主要用于类风湿性关节炎、骨关节炎

8、、痛风性关节炎所引起的 关节红肿疼痛、屈仲不利等症。知母清热泻火，滋阴润燥，具有抗肿瘤、改善老 年性痴呆症状、降糖、降脂、抗动脉粥样硬化、抗凝血、抗炎、改善骨质疏松症 状等作用；赤芍清热凉血，活血祛瘀，具有保肝、抗肿瘤、祌经保护、心脏保护、 抗血栓、抗氧化等多种药理作用；忍冬藤具有清热解毒，疏风通络的功效，临床 用于抗病毒、抗炎解热、抗肿瘤及提高机体免疫力;车前草具有淸热利鉍通淋、 祛痰、凉血、解毒的功效，用于热淋涩痛、水肿尿少、暑湿池泻、痰热咳嗽、吐 血衄血、痈肿疮毒。芒果苷、芍药苷、马钱苷、大车前苷分别为知母、赤芍、忍 冬藤和车前草中主要的活性成分。目前该制剂的现有标准只有相关鉴別项，较为

9、 简单，为了更有效的控制本品的质量，本实验采用薄层色谱法对方中知母、赤芍、忍冬藤和车前草进行定性鉴别，同时采用反向高效液和色谱法，建立热痹清 颗粒中主要活性成分马钱苷、芍药苷的含量测定方法，为热痹清的质量控制提供 科学依据。1.材料1.1仪器岛津lc-20a高效液和色谱仪（日本岛津）、lc solution色谱工作站;kq3200b 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；tlc scanner4薄层扫描仪（camag 瑞士卡玛）；al104梅特勒-托利多电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公 司）；岛津auw-120d电子天平（日本岛津）。1.2试药芒果苷（中国药品生物制品检定研宄所,批号：

10、111607-201503，98.4%）,芍药 苷（中国药品生物制品检定研究所,批号：110736-201438, 96.4%）,马钱苷 （中国药品生物制品检定研究所，批号：111640-201005, 99.2%）,大车前苷（中 国药品生物制品检定研究所，批号：111914-201102，85.9%），知母对照药材 （中国药品生物制品检定研宄所，yj-121070）,忍冬藤对照药材（中国药品生物 制品检定研宄所，yj-121069），甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂 均为分析纯。热痹清颗粒（由武汉市中医药学基地制剂中心提供，批号 为:20160512、20160808、2017022

11、3,规格：10gx 10 袋/盒）2.方法与结果2. 1 tlc鉴别2.1.1知母鉴别15取本品粉末3 g,加稀乙醇10 m l,超声（功率150 w,频率40 k hz）处理20 min,过滤，滤液置水浴上蒸干，残渣加稀乙醇1 m l使溶解，作为供试品溶液。取知母对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。再取芒果苷对照品，加稀乙醇 制成每iml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典 2015年版四部通则0502）试验，吸取上述三种溶液各4 ul,分别点于同一聚酰 胺薄膜上，以乙醇-水（1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱屮，在与对

12、照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同 颜色的荧光斑点，阴性无干扰，结果见图1。图 1 知母的鉴别 fig 1 identification of anemarrhena 下载原图2.1.2赤芍鉴别15取本品3g,研细，加乙醚50 m l,置水浴上加热回流lh,滤过，药渣加甲醇 50 m l,加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 m l使溶解，用水饱和 的正丁醇提取3次，每次20 m l，合并正丁醇液，用水洗涤3次，蒸干，残渣 加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每lm l含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2015年版四 部通则050

13、2)试验，吸取上述两种溶液各10此，分别点于同一硅胶g薄层板上， 以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8:1:2:0.04)为展开剂，展开，取出，晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色 谱相应的位置上，显相同颜色的蓝紫色斑点，阴性无干扰，结果见图2。图 2 赤勺的鉴别 fig 2 identification of radix paeoniae rubra 下载原 图2. 1.3忍冬藤鉴别15取本品粉末1 g，加50%甲醇10 m l,超声（功率150 w,频率40 k hz）处理 30 min,滤过，滤液蒸干，残渣加50%甲醇1 m l,作为供试品溶液。另

14、取忍冬 藤对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。再取马钱苷对照品，加50%甲醇制成 每1 m l含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015 年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各10 pl、对照品溶 液5pl,分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（65:35:10）10°c以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°c加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品 色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰，结果见图3。图 3 忍冬藤的鉴别 fig 3 identific

15、ation of cau 1 is lonicerae下载原图2.1.4车前草鉴别15取本品粉末2 g,加甲醇10 m l，超声（功率150 w,频率40 k hz）处理30 min, 滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加甲醇iml使溶解，作为供试品溶液。另取大 车前苷对照品，加甲醇制成每1 m l含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层 色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各 10 ul,分别点于同一硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水 （18:3:1.5:1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 rnn）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱和应的位

16、罝上，显和同颜色的斑点，阴性无干 扰，结果见图4。图4车前草的鉴别fig. 4 identification of plantain 下载原图2.2含量测定 2. 2.1色谱条件色谱柱:wondasil ci8 （4.6 mmx 250 mm, 5 pm）;柱温：30°c ;流动相：乙腈（a） -0.2%磷酸（b）梯度洗脱（表1）;检测波长:236 nm （cf25 min,马钱苷）、230 nm （2535 min,苟药苷）;流速:1.0 m l min;进样量:10 u l。下载表 1 梯度洗脱顺序 tab 1 gradient elution mode of mobile ph

17、ase 原表时间/min表 1 梯度洗脱顺序 tab 1 gradient elution mode of mobile phase下载原表5772525352. 2.2溶液的制备2.2.2. 1混合对照品分别精密称取马钱苷、芍药苷对照品1.2, 3. 19 mg,置10 m l量瓶中，加甲醇 超声（功率150 w，频率40 khz）溶解并稀释至刻度，即得混合对照品溶液。2.2.2. 2供试品溶液的制备取热痹清颗粒样品lg，精密称定，罝具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 m l， 超声（功率150 w,频率40 khz）提取20 min,放冷，过滤，滤液蒸干，残渣 用甲醇溶解，转移至5 m

18、l量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 phi微孔滤膜 过滤，取续滤液，作为供试品溶液。2.2.2. 3阴性样品溶液的制备按热痹清颗粒生产工艺制备缺忍冬藤、赤芍的阴性制剂，并按供试品溶液制备方 法制备阴性供试品溶液。2. 2.3专属性试验精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，按“2.2.1”项下色谱 条件进样，记录色谱图。结果表明，供试品色谱中，在与对照品色谱相砬的出峰 时间出相同的峰，且阴性制剂对所测组分无干扰。（见图5）102030 t/min2in图 5 热痹清颗粒 hplcfig 5 hplc chromatograms of rebiqing granule 下 载原图

19、a.对照品;b.热痹清颗粒样品;c.缺忍冬藤阴性;d.缺赤芍阴性；1-马钱苻;2-芍药 什 a.reference product;b. rebiqing granules;c. negative sample without caul is loniccrac;d. negative sample without radix paconiac rubra;1-1oganin;2-paeoniflorin2.2.4线性关系的考察分别精密吸取“2.2.2. 1”项下混合对照品溶液2, 4, 8，12, 16, 20ul注入高 效液相色谱仪，在“2.2. 1”条件下测定峰面积。以进样量（x，ug）

20、为横坐标， 峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得马钱苷和芍药苷的回归方差分别为 y=1479872. 40x+2963. 23 （r=0. 999 9） , y=1 178 698. 45x-79 483. 32 （r=0. 999 9）;线性范围分别为0.2402. 400，0. 6386. 380 u g。2. 2.5精密度试验精密吸取同一混合对照品溶液10 ul，按“2. 2.1”项不条件重复进样6次，记 录峰面积。按峰面积计算，结果马钱苷、芍药苷的rsd值分别为0.78%、1.20% （n=6）,表明仪器精密度良好。2.2.6重复性试验取同一批号的热痹清颗粒样品6份（批号:20170

21、223）,按“2. 2. 2. 2”项下方法 平行制备6份供试品溶液，各吸取10ul进样，记录峰面积，结果马钱苷、芍药 苷的rsd值分别为2. 00%、2. 06% （n=6），表明本方法重复性良好。2. 2.7稳定性试验取同一供试品（批号:20170223）溶液，按“2.2.1”项下条件分别在0, 2, 4, 6 8, 24 h进行测定，记录峰面积，结果马钱苷、芍药苷的rsd值分别为1.68%、 0.65% （n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。2.2.8加样回收率试验称取同一批号供试品（批号20170223） 6份，每份约0. 5 g,精密称定，分别加 入马钱苷、芍药苷对照品适量，按

22、“2. 2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液，按 “2.2. 1”项下色谱条件进行测定，计算冋收率。马钱苷和芍药苷的平均加样冋 收率分别为100. 04%、98.35%，rsd分别为1.46, 1.64 06），本方法回收率 良好。结果见表23。表2马钱苷加样回收率试骑结果tab 2 spiked recovery rate of 1 ogan in下载原表0. 5131i 1 hh j1-1王/ r 亡282. 87228.60. 5169284. 97227.60. 5084280. 28280. 30. 5086280. 39280.60. 5686313.47376. 10. 567

23、6312.89375.9表3苟药苷加样回收率实验结果tab 3 spiked recovery rate ofpaeon i florin下载原表称样量/g样品芍药苷含量/ug加入量/0. 5131883. 17708. 70. 5169889. 71709.60. 5084875. 16876.00. 5086875. 51875.60. 5686978.791176j0. 5676976. 981173.2.2.9样品测定取3批样品（批号为:20160512、20160808、20170223),每批 3 份，按“2. 2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液，按“2. 2. 1”项下色谱条

24、件进行测定，记录峰面积，测定含量。结果见表4表 4 样品含量测定(n=3) tab 4 content determination of samples (n=3)下载原表批号马钱苷/mg *201605120. 370201608080. 550'201702230. 551；3讨论3.1屮药复方制剂化学成分复杂，采用色谱法对其质量进行控制干扰因素较多。 本实验采用薄层色谱法对热痹清颗粒中知母、赤芍、忍冬藤、车前草进行了定性 鉴别，其结果分离度较好，专属性强。同时本实验通过高效液和色谱法建立了热 痹清颗粒中马钱苷、芍药苷的含量测定方法，经过方法学考察和含量测定，该方 法准确、可靠，操

25、作简单，专属性强，可作为热痹清颗粒中马钱昔、芍药苷的含 量测定方法。3.2结合紫外吸收光谱阁以及中国药典2015年版中记录的检测波长，忍冬藤 中马钱苷的含量测定检测波长为236 nm，赤芍中芍药苷的检测波长为230 nm， 利用二极管阵列检测器波长切换的功能，结合这两种成分的出峰保留时间和最 大吸收波长，设定025 nrin检测波长为236 rnn测定马钱苷，2535 min检测波 长为230 测定芍药苷，在此条件下两种对照品溶液及供试品溶液均有较好的 吸收。3. 3本实验曾以甲醇-0.05 mol l磷酸二氢钾溶液15、乙腈-0. 01%甲酸16、 乙腈-0. 05%磷酸17、乙腈-0. 2

26、%磷酸进行流动相考察，结果甲醇-0.05 mol - l 磷酸二氢钾溶液、乙腈-0. 01%甲酸为流动相洗脱吋，供试品中各色谱峰分离度较 低，采用乙腈-0.05%磷酸为流动相时，色谱峰分离度有所提高，但是拖尾明显， 在详细考察了热痹清颗粒中九种中药的主成份、样品处理方法、液相条件及含量 后设定乙腈-0.2%磷酸为流动相，色谱峰的拖尾现象明显好转，故最终采用乙腈 -0. 2%磷酸系统作为流动相。综上所述，本实验采用薄层色谱法和高效液相色谱法对热痹清颗粒分别进行了 定性和定量鉴别，本方法专属性强，结果准确，可用于热痹清颗粒的质量控制， 为临床安全科学用药提供了指导。参考文献1 sun xinghu

27、an，zhang yuwei, huang xuefeng. advances in studies on chemical constituents and pharmacological effects of anemarrhenaj. strait medicine (海峡药学)，2015, 27 (3) :6-122 zhao chuncao, wu fei, zhang jiquan, et al. progress in pharmacological studies of anemarrhenaj chinese journal of new drugs and clinical

28、 remedies (中国新药与临床杂志)，2015 (12) :898-9023 deng yun, ma baiping, cong yu'ven，et al. progress in the study of pharmacological effects of anemarrhena and its active constituents on improving brain function j. chinese pharmacological bulletin (中国药理 学通报)，2008，24 (5) : 576-5794 lu xiaohua, ma xiao, wa

29、ng jian，et al. advances in the study of chemical constituents and pharmacological effects of radix paeoniae rubraj. chinese herbal medicine (中草药)，2015，46 (2) :595-6025 wang rui，lu lan, li yingwei, et al. pharmacological effects of radix paeoniae rubra and paeonia lactiflora pallj. chinese journal of

30、 experimental traditional medical formulae (中国实验方剂学)，2010 (16) :112-1146 tao chun, xuan liying，lin ling. the main chemical constituents and pharmacological actions of paeonia lactif lora pall. j. journal of inner mongolia university for nationalities (内蒙古民族大学学报)，2014(2) : 198-2017 fan mali, xing jie

31、，li zhenyu, et al. comparative study on chemical constituents of paeonia lactif lora and radix paeoniae rubra based on nmr metabonomicsj. chinese herbal medicine (中草药)，2014，45(22) :3230-32378 lu siai. research progress in chemical constituents andpharmacological applications of caul is loniceraej. j

32、ournal of linyi university (临沂大学学报)，2012，34 (3) : 132-1349 jia xianhui, li jing, zhang yongqing. advances in studies on chemical constituents of caul is loniceraej. shandong journal of traditional chinese medicine (山东中医杂志)，2015，34 (8) :641-64310 wen shiyong, tan weimin, gong limin，et al. advances in studies on resources and quality control of caul is loniceraej. central south pharmacy (中南药学)，2017 (3) : 335-33811 zhang cong, yin zhiqi, ye wencai, et al. study on chemical constituents of caulis loniceraej