常用培养基的制备实用教案

1、培养基种类培养基种类: :碳源、氮源、能源、生长因子、碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水无机盐、水一、按成份的不同一、按成份的不同(b tn(b tn) )划划分分 天然培养基、合成培养基、天然培养基、合成培养基、半合成培养基半合成培养基二、按培养基的物理状态划分二、按培养基的物理状态划分 固体培养基、液体培养基、固体培养基、液体培养基、半固体培养基半固体培养基三、按培养基用途划分三、按培养基用途划分 基础培养基、加富培养基、基础培养基、加富培养基、鉴别培养基、选择培养基鉴别培养基、选择培养基 第1页/共62页第一页，共63页。牛肉牛肉(ni ru)膏蛋白胨培养基膏蛋白胨培养基 牛肉膏蛋白

2、牛肉膏蛋白(dnbi)(dnbi)胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏牛肉膏3g3g，蛋白，蛋白(dnbi)(dnbi)胨胨10g10g，Nacl5gNacl5g，琼脂，琼脂151520g20g，水，水1000mL1000mL，PH7.0PH7.07.2(7.2(后调后调) )第2页/共62页第二页，共63页。高氏高氏1 1号培养基号培养基 高氏高氏1 1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下： 可溶性淀粉可溶性淀粉(dinfn

3、)20g(dinfn)20g，KNO3 1gKNO3 1g，NaCl 0.5gNaCl 0.5g，K2HPO43H2O 0.5gK2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5gMgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01gFeSO47H2O 0.01g，琼脂，琼脂151520g20g，水，水1000mL1000mL，pH7.4pH7.47.67.6。 第3页/共62页第三页，共63页。查氏合成查氏合成(hchng)培养基培养基 查氏合成培养基是用来查氏合成培养基是用来(yn li)分类和培养霉菌的培养基分类和培养霉菌的培养基,其配方如下：其配方如下： NaNO3 3g

4、,K2HPO4 1g, KCl 0.5g, MgSO4.7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖蔗糖 30g, H2O 1000ml,pH自然自然第4页/共62页第四页，共63页。麦芽麦芽(mi y)汁培养基汁培养基 用来培养酵母菌用来培养酵母菌, ,干麦芽粉加干麦芽粉加4 4倍水倍水, ,在在50-6050-60保温糖化保温糖化3-43-4小时，用碘液试验检查至糖化完全为止小时，用碘液试验检查至糖化完全为止, ,调整调整(tiozhng)(tiozhng)糖液浓度糖液浓度, ,煮沸后，过滤，调煮沸后，过滤，调pHpH为为6.06.0。第5页/共62页第五页，共63页。消毒与灭菌消毒：

5、消灭病原菌和有害微生物的营养体灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。方法：物理的方法：加热、过滤(gul)、辐射化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 第6页/共62页第六页，共63页。加热法：加热法：干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌1 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（、热空气灭菌利用高温干燥空气（160160170C170C）加热灭菌）加

6、热灭菌1 12h2h，适用于玻璃器皿和，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关含量有关(yugun)(yugun)，当环境和细胞含水，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。量越大，凝固越快。3 3、注意事项：、注意事项： 1 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；法； 2 2）温度控制在）温度控制在180180； 3 3）物品不能太挤；）物品不能太挤； 4 4）温度降至）温度降至7070时才开箱门。时才开箱门。 第7页/共62页第七页，共63页。第8页/共62页第八页，共63页。湿热法湿热法 ：原

7、理：因为湿热中菌体吸水，蛋原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。效果比同温度下干热好。高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法：1 1、设备：高压灭菌锅、设备：高压灭菌锅2 2、时间长短根据灭菌物品的种、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。类和数量不同有所变化。3 3、适用于培养基、工作服、橡、适用于培养基、工作服、橡胶胶(xingjio)(xingjio)物品等的灭菌，物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。也可用于玻璃器皿的灭

8、菌。4 4、注意事项：、注意事项： 1 1）冷空气彻底排除；）冷空气彻底排除；2 2）加）加水；水；3 3）压力降为）压力降为“0”“0”时方可时方可打开。打开。 第9页/共62页第九页，共63页。 在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量锅内留有不同分量

9、(fn ling)空气时，压力与温度的关系见表空气时，压力与温度的关系见表2第10页/共62页第十页，共63页。第11页/共62页第十一页，共63页。 常压蒸汽灭菌： 对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基，含糖培养基等可采用此法。彻底灭菌则采用间歇灭菌方法(fngf)。 煮沸灭菌法： 适用注射器和解剖器皿，时间1015min， 超高温杀菌 135-150C和2-8s对牛乳和其它液态食品灭菌。 优点 ：保持食品价值和营养成分。第12页/共62页第十二页，共63页。 过滤除菌：过滤除菌： 原理：介质在有压力时阻隔微生物。原理：介质在有压力时阻隔微生物。 适用范围：许多材料如血清、

10、抗生素及糖溶液采用此法。适用范围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。 设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。 优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。 注意事项：注意事项：1 1、压力适当；、压力适当； 2 2、无菌条件下进行；、无菌条件下进行； 3 3、防止、防止(fngzh)(fngzh)渗透现象。渗透现象。 第13页/共62页第十三页，共63页。 辐射灭菌： 原理：紫外线波长在200300nm，具有杀菌作用，以265-266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力(xio l)与强度和时间

11、的乘积成正比。 缺点：穿透力不大。距照射物1.2m为宜。 应用：无菌室，医院。 注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。 第14页/共62页第十四页，共63页。 化学药品灭菌： 原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。 杀菌剂如重金属离子； 抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。 注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类以及微 生物所处的环境(hunjng)有关。 常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸 福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等第15页/共62页第十五页，共63页。 分离与纯化：从混杂(hnz)的微生物群体中获得只含某一种 或某一株微生物的过程。 为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落并不一定保 证是

12、一种菌。 常用的分离、纯化方法： 单细胞挑取法、稀释涂布平板法 稀释混合平板法、平板划线法 实验实验(shyn)四四 微生物的分离、微生物的分离、纯化及培养技术纯化及培养技术第16页/共62页第十六页，共63页。稀释涂布平板法 ： 步骤： 1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏I号培养基，查氏培养基冷却至55-60时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨培养基倒4皿，高氏I号培养基和查氏培养基各倒3皿。 2、制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中，在三角瓶中振摇20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml无菌水的试管中，以此类推，制成不同稀释度。 3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然

13、后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。 4、培养：高氏I号和查氏倒置培养于28培养箱中培养3-5days，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在37培养1-2days。 5、挑菌落：转至斜面(ximin)，检查是否一致，保存。 第17页/共62页第十七页，共63页。第18页/共62页第十八页，共63页。 平板划线法： 1、倒平板，标记(bioj)培养基名称，编号和实验日期。2、划线方法 稀释混合平板法 ：1、先加菌2、倒平板时注意培养基温度3、混合均匀第19页/共62页第十九页，共63页。 微生物培养技术微生物培养技术1、斜面接种、斜面

14、接种(jizhng)2、液体培养基接种、液体培养基接种(jizhng)3、穿刺接种、穿刺接种(jizhng)将已接种将已接种(jizhng)的斜面、半固体和的斜面、半固体和液体培养基放置培养箱液体培养基放置培养箱中培养将生长好的菌种用牛皮纸包好，中培养将生长好的菌种用牛皮纸包好，置置4冰箱中冰箱中保存。保存。第20页/共62页第二十页，共63页。观察菌落观察菌落(jnlu)形态并记录形态并记录序号 来源 大小(dxio) 形状 边缘 颜色 表面 代谢物 种类第21页/共62页第二十一页，共63页。实验五：放线菌及霉菌(mjn)形态观察目的要求目的要求1.了解了解(lioji)放线菌、霉菌的形放

15、线菌、霉菌的形态观察的原理。态观察的原理。2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。态的操作方法。3.初步了解初步了解(lioji)放线菌、霉菌放线菌、霉菌的形态特征。的形态特征。第22页/共62页第二十二页，共63页。原理(yunl)放线菌是一群丝状，放线菌是一群丝状，G+G+的细菌，在气生菌丝末的细菌，在气生菌丝末端形成孢子。端形成孢子。细胞壁主要成分是肽聚糖，最适细胞壁主要成分是肽聚糖，最适pHpH与细菌相似。与细菌相似。主要以孢子方式进行主要以孢子方式进行(jnxng)(jnxng)无性繁殖。无性繁殖。其其DNA DNA 碱基组成中碱基组成中GCGC含量

16、特别高。超过任何含量特别高。超过任何已知的细菌。已知的细菌。 许多临床应用的抗生素都由链霉菌种产生。许多临床应用的抗生素都由链霉菌种产生。 放线菌(Actinomycetes)第23页/共62页第二十三页，共63页。第24页/共62页第二十四页，共63页。分生孢子丝琼脂(qingzh)表面基内菌丝气生菌丝The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium （基内菌丝）and aerial mycelium（气生菌丝） with chains of conidiospores（分生孢子）第25页/共

17、62页第二十五页，共63页。分生孢子丝琼脂(qingzh)表面基内菌丝气生菌丝The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium（基内菌丝） and aerial mycelium （气生菌丝）with chains of conidiospores（分生孢子）第26页/共62页第二十六页，共63页。 放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态丝形态(

18、xngti)(xngti)多样，有直、弯曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态多样，有直、弯曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态(xngti)(xngti)。孢子也有球形、椭。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态(xngti)(xngti)构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。 放线菌的菌落放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。早期绒状同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。第27页/共62页第二十七页，共63页。链霉菌(mjn)

19、的各种孢子丝结构第28页/共62页第二十八页，共63页。链霉菌的分离 ： pH中性(zhngxng)偏碱 喜干（含水少） 采用含各种无机盐的选择性培养基第29页/共62页第二十九页，共63页。已知放线菌能够产生500多种抗生素。大多数抗生素对不同的细菌有独特的疗效(lioxio)有50多种被实际应用Antibiotics放线菌Actinomycetes 第30页/共62页第三十页，共63页。霉菌(mjn) ( molds) 是丝状真菌的总称是丝状真菌的总称, ,即即“发霉的真菌发霉的真菌”。通常指菌丝体比较发达而又不产生大型子。通常指菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。常在潮湿的气候下大

20、量实体的真菌。常在潮湿的气候下大量(dling)(dling)生长繁殖。生长繁殖。第31页/共62页第三十一页，共63页。形态(xngti)特征（ Morphological characteristics ） 属异养型真核生物，具有(jyu)丝状或管状结构，单个分支称为菌丝。菌丝形成的网络状结构称为菌丝体。 营养菌丝（vegetative mycelium）：汲取营养 气生菌丝（aerial mycelium） 繁殖菌丝:孢子丝，进行繁殖。第32页/共62页第三十二页，共63页。分类(fn li)（classification） 有隔菌丝：有隔菌丝中有横隔膜将菌丝分隔成多个细胞，在菌丝生长过

21、程中细胞核的分裂伴随着细胞的分裂，每个细胞含有一至多个细胞核。横隔膜可以使相邻细胞之间的物质相互沟通。如曲霉和青霉。 无隔菌丝：菌丝中无横膈膜，整个(zhngg)细胞是一个单细胞，菌丝内有许多核，在生长过程中只有核的分裂和原生质体质量的增加，没有细胞数目的增多。如毛霉和根霉。第33页/共62页第三十三页，共63页。(1)nonseptate(2)septate第34页/共62页第三十四页，共63页。繁殖繁殖(fnzh)(fnzh)方式方式 无性繁殖： 芽生孢子(boz) 节孢子(boz) 孢囊孢子(boz) 后垣孢子(boz) 分生孢子(boz) 有性繁殖： 卵孢子(boz) 接合孢子(boz

22、) 子囊孢子(boz)第35页/共62页第三十五页，共63页。Sporangiospores 孢囊孢子(boz)（Sporangiospores are formed within a sporangium ）第36页/共62页第三十六页，共63页。节孢子(boz)Arthrospores第37页/共62页第三十七页，共63页。分生孢子分生孢子ConidiosporesConidiospores第38页/共62页第三十八页，共63页。卵孢子卵孢子（OosporesOospores）antheridiumoospheresoosporesoogoniumOospores formation第39

23、页/共62页第三十九页，共63页。接合孢子接合孢子 ZygosporesZygospores第40页/共62页第四十页，共63页。接合孢子接合孢子形成形成(xngchng)(xngchng)过程过程第41页/共62页第四十一页，共63页。子囊孢子子囊孢子 AscosporesAscospores第42页/共62页第四十二页，共63页。几种(j zhn)常见霉菌第43页/共62页第四十三页，共63页。根霉第44页/共62页第四十四页，共63页。 根霉的形态(xngti)结构第45页/共62页第四十五页，共63页。曲霉(qmi)第46页/共62页第四十六页，共63页。曲霉(qmi)的形态结构左侧分

24、生孢子梗具有一层小梗；右侧分生孢子梗具 有二层小梗第47页/共62页第四十七页，共63页。 青霉青霉第48页/共62页第四十八页，共63页。 青霉的形态结构 A单轮型 B非对称(duchn)型 C对称(duchn)二轮型第49页/共62页第四十九页，共63页。实验实验(shyn)内容内容人们设计了各种培养和观察方法人们设计了各种培养和观察方法(fngf)(fngf)，这，这些方法些方法(fngf)(fngf)的主要目的是为了尽可能保持的主要目的是为了尽可能保持放线菌和霉菌自然生长状态下的形态特征。本实放线菌和霉菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片法。验采用插片法。第50页/共62页第五十

25、页，共63页。插片法插片法: 倒平板倒平板插片插片接种接种培养培养镜检镜检记录绘图记录绘图 压印法压印法: 倒平板倒平板划线接种划线接种挑取菌落挑取菌落(jnlu)加盖玻片加盖玻片镜检镜检记录绘图记录绘图 埋片法埋片法: 倒琼脂倒琼脂切槽切槽接种接种培养培养镜检镜检记录绘图记录绘图 第51页/共62页第五十一页，共63页。 倒平板倒平板 将培养基熔化后，倒将培养基熔化后，倒10-1210-12毫升左右于灭菌培养毫升左右于灭菌培养皿内，凝固后使用皿内，凝固后使用. . 插片插片 将灭菌的盖玻片以将灭菌的盖玻片以4545度角插入培养皿内的培养度角插入培养皿内的培养基中，插入深约为基中，插入深约为1

26、/21/2或或1/31/3。 接种与培养接种与培养 用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，放置线，放置2828培养培养3 37 7天。天。 观察观察 培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面面(y min)(y min)的菌丝体，将生长良好的菌丝体的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压放于载玻片上。直接在显微面向的载玻片，压放于载玻片上。直接在显微镜下观察。镜下观察。 第52页/共62页第五十二页，共63页。关键步骤及注意

27、事项关键步骤及注意事项 倒平板要厚一些，接种时划线要密。倒平板要厚一些，接种时划线要密。 插片时要有一定角度并与划线垂直插片时要有一定角度并与划线垂直(chuzh)(chuzh)。 观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。 如果用如果用0.1%0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。 第53页/共62页第五十三页，共63页。思考题思考题镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?你认为霉菌和放线菌菌丝的主要区别(qbi)是什么？第54页/共62页

28、第五十四页，共63页。 实验(shyn)六、菌种保藏 几种常用(chn yn)的保藏方法： 1、传代培养法 保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4C冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。 可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。 2、载体法 使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。 常用(chn yn)的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。第55页/共62页第五十五页，共63页。 3、悬液法 将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。 溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。 4、冷冻法 使菌种始终存放在低温环境

29、下的保藏方法。包括低温法和液氮法。 此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速率及保护剂的使用。 5、真空干燥法 这类方法包括冷冻真空干燥法和L干燥法。 冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品(yngpn)先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。 L-干燥法则不需要低温预冻样品(yngpn)，只是使样品(yngpn)维持在1020C范围内进行真空干燥。第56页/共62页第五十六页，共63页。 操作方法 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C冰箱中包藏。 保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存

30、24个月移种一次，酵母菌间隔(jin g)两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。 此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。第57页/共62页第五十七页，共63页。 2、液体石蜡保藏法 将无菌石蜡加在已长好菌的斜面(ximin)上，其用量以高出斜面(ximin)顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。 将试管直立，置低温或室温下保存。 此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏12年，普通细菌也可保藏1年左右。 3、穿刺保藏法 按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4冰箱存放。第58页/共62页第五十八页，共63页。 4、砂土管保藏法 （1

31、）河砂处理 取河砂若干加入盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。（）土壤处理 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。 (3)砂土混合 处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例(bl)掺合(或根据需要而用其他比例(bl)，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10 x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2-3次)，最后烘干。 第59页/共62页第五十九页，共63页。 (4)无菌检查 每10支砂土管随机抽1支，将砂土倒入肉汤培养基中，30培养40h，若发现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再作无