第二章微生物的纯培养和显微技术

1、黄升海 教授安徽医科大学微生物学教研室培养物（culture）：在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物。纯培养物（pure culture）：只有一种微生物的培养物称为纯培养物。 纯培养技术纯培养技术是进行微生物学研究的基础，是微生物学的基本技术之一。显微技术显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术。正是由于显微技术和纯培养技术的建立，才使我们得以认识丰富多彩的微生物世界，对其真正研究，使其发展为一门学科。第一节 微生物的分离和纯培养第二节 显微镜和显微技术第三节 显微镜下的微生物 一、无菌技术（aseptic technique） 1、概念：在分离、转接及培养纯

2、培养物时 防止其被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术。 2、方法：器具、培养基及其灭菌 接种操作无菌操作 固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基。 细菌的固体培养特征： 菌落（菌落（colony）：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。每个菌落一般是由单个微生物活体细胞生长、繁殖形成的纯培养物。二、用固体培养基获得纯培养 菌落特征：有光滑型、粗糙型和粘液型三种。 如湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑起、质地均匀、菌落正反面及边缘与中央部分的颜色一致。 生物学意义：不同微生物在特定培养基上生长形

3、成的菌落（或菌苔）一般都具有稳定的特征，是微生物分类鉴定的指征之一。 菌苔（菌苔（lawn）：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔（lawn）。菌落 目前实验室常用固体培养基获得微生物目前实验室常用固体培养基获得微生物纯培养物的几种方法：纯培养物的几种方法：1、涂布平板法（spread plate method)2、稀释倒平板法(pour plate method，50左右)3、平板划线法(streak plate method)（如四区划线）4、稀释摇管法(shake tube method)涂布平板法与稀释倒平板法涂布平板法与稀释倒平板法12平板划线法平板划线法稀释摇管法（分离厌

4、氧菌）稀释摇管法（分离厌氧菌）三、用液体培养基获得纯培养-稀释法 适用于一些个体大的细菌、许多原生动物和藻类等。通过高度稀释，使一支试管中分配不到一个微生物。同一个稀释度应有较多的平行试管。四、单细胞（孢子）分离-显微分离法 对操作技术要求较高，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。 1、选择平板培养根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件（对于从自然界中分离、寻找有用的微生物十分重要，如从土壤中筛选蛋白酶产生菌，分离高温菌，分离某种抗菌素抗性菌株） 2、富集培养加富性选择培养基（投其所好）-对羟基苯甲酸抑制性选择培养基（取其所抗）-致病性肠道杆菌五、选择培

5、养五、选择培养六、微生物的保藏技术六、微生物的保藏技术 菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。 保藏的方法： 传代培养保藏 4 冷冻保藏 -196，-70，-30-20 干燥保藏法 沙土管，安瓿管（冷冻真 空干燥保藏，最普遍最重要） 绝大多数微生物的大小都远远低于肉眼的观察极限，因此一般必须借助显微镜放大系统的作用，才能看到它们的个体形态和内部结构。 除了放大外，决定显微观察效果的还有两个重要因素，分辨率和反差分辨率和反差。分辨率是指能辨别两点之间最小距离的能力，而反差是指样品区别于背景的程度，它们与显微镜的自身特点有关，也取决于进行显微观察时

6、对显微镜的正确使用以及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术显微技术。 现代显微技术不仅仅是观察物体的形态、结构，而且发展到对物体的组成成分的定性和定量，特别是与计算机技术结合出现的图像分析、模拟仿真等技术，为探索微生物的奥秘提供了强大武器。一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理 1、普通光学显微镜3、相差显微镜4、荧光显微镜（激光共聚焦显微镜）5、透射电子显微镜7、扫描隧道显微镜二、显微观察样品的制备二、显微观察样品的制备 1、光学显微镜的制样 （1）活体观察：压滴法 悬滴法 菌丝埋片法（玻璃纸，涂布 放线菌或霉菌孢子悬液，培养，镜下） （2）染色观察死菌细菌染色法正染色简单染色法鉴

7、别染色法抗酸染色法革兰染色法芽孢染色法姬姆萨染色法负染色 ：荚膜染色法等活菌：活菌：用美蓝或TTC（氧化三苯基四氮唑）等做活菌染色2、电子显微镜的制样 （1）透射电镜的样品制备 1）负染技术 2）投影技术 3) 超薄切片技术：取材固定脱水浸透与包埋切片捞片染色观察（2）扫描电镜的样品制备 利用电子束作光栅状扫描以取样品的形貌信息。 主要要求样品干燥，且表面能够导电。 干燥方法：自然干燥 真空干燥 冷冻干燥 临界点干燥等微生物：细胞型：凡具有细胞形态的微生物 非细胞型：细胞型微生物：细菌（Bacteria) 古生菌（Archaea） 真核生物（Eukarya） 定义：以二分裂为主要繁殖方式的单细

8、胞原核微生物。 1、细菌的形态和排列 三种基本形态： 球状：一个分裂面、两个分裂面、 三个分裂面、无定向分裂面 杆状：单杆、链杆、栅状、八字 螺旋状：弧菌、螺旋菌一、细菌一、细菌单球菌细胞分裂沿一个平面进行，新个体分散而单独存在。如尿素微球菌双球菌细胞沿一个平面分裂，新个体成对排列。如肺炎链球菌四联球菌细胞分裂是沿两个相垂直的平面进行，分裂后每四个细胞特征性地连在一起，成田字形。如四联微球菌链球菌细胞沿一个平面进行分裂，新个体不但可保持成对的样子，并可连成链状。如乳链球菌、无乳链球菌、溶血性链球菌八叠球菌细胞按三个互相垂直的平面进行分裂后，每八个球菌特征性地连在一起形成立方体形。如藤黄八叠球菌

9、葡萄球菌细胞无定向分裂，多个新个体形成一个不规则的群体，犹如一串葡萄。如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌杆菌杆菌的基本形态 短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、月亮状、竹节状、分枝状等；按杆菌细胞繁殖后的排列方式则有链状、栅状、“八”字状等杆菌细胞的排列方式 链状、栅状、八字状、鞘衣包裹的丝状等短杆状长杆状梭状芽孢菌螺旋菌根据螺旋环的数目将螺旋状细菌分为： 弧菌： 螺菌：26环的小型坚硬的螺旋状细菌，有 鞭毛，靠鞭毛运动。 螺旋体：高于6环，体长而柔软的螺旋状细 菌，无鞭毛，靠周质间轴丝伸缩运动。其他形态： 柄细菌 球衣菌 支原体 星型细菌细菌的菌落特征： 表面湿润，小而突起或大而平坦、易挑起柄细菌

10、球衣菌支原体星型细菌 细菌的形态受温度、pH、培养基成分和培养时间等因素影响很大。一般是细菌在适宜的生长条件下培养818h时形态比较典型，在不利环境或菌龄老时常出现梨形、气球状和丝状等不规则的多形性（polymorphism），称为衰退型（involution form）。因此，观察细菌的大小和形态，应选择其适宜生长条件应选择其适宜生长条件下的对数期为宜。下的对数期为宜。 与细菌类似的个体形态，但多生活于一些生存条件十分恶劣的极端环境中，如高盐、高温、高酸等。如“121株”能在121的条件下繁殖。 细菌大小量度单位：微米（m） 亚细胞构造的量度单位：纳米（nm） 常见细菌的大小： 球菌：直径

11、0.51.0m 杆菌：宽长 0.51.01.05.0m 螺形菌：宽长 0.51.01.050m 最小的细菌：纳米细菌，细胞直径最小为50 nm，甚至比最大的病毒更小一点。 最大的细菌：一种硫磺细菌，其大小一般在 0.10.3 mm，但有些可达0.75mm，相当于果蝇头部的大小，能够清楚地用肉眼看到。命名为Thiomargarita namibiensis，即“纳米比亚硫磺珍珠菌”。图中箭头所指的是直径在0.5mm的一个Thiomargarita namibiensis菌体，其体积几乎与果蝇头部的大小相当。1、霉菌（mold） 一些“丝状真菌”的统称，霉菌菌体均由分支或不分支的菌丝（hypha）构成，许多菌丝交织在一起，称为菌丝体。 霉菌菌丝：无隔膜菌丝 有隔膜菌丝 菌丝体形态：营养菌丝：深入培养及吸收营养 气生菌丝：向空中生长 繁殖菌丝：产生孢子霉菌在自然界分布极广霉菌在发酵工业上的应用霉菌也是造成许多食品霉变变质的主要原因概念：酵母菌是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真菌的总称。 酵母菌超过600种，分属于39个属。形态与大小：卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形等 大小：(15）m（530）