超高效液相色谱串联质谱测定营养强化食品中维生素B12的含量

1、（自然科学版）JOURNAL OF SHANGHAI UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE)第 20 卷 第 1 期2014年2月Vol. 20 No. 1Feb. 2014DOI: 10.3969/j.issn.1007-2861.2013.07.016超高效液相色谱-串联质谱测定营养强化食品中维生素 B12 的含量马颖清1,王霞1,张小刚1,罗立强2(1. 上海德诺产品检测, 上海 200436; 2. 上海大学 理学院, 上海 200444)(本刊编委曹卫国推荐)摘要:采用固相萃取(solid phase extraction, SPE)柱对样品中维生素 B12 进行浓

2、缩与净化,提出了一种可灵敏测定营养强化食品中维生素 B12 含量的超高效液相色谱-串联质谱(ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)方法,并通过实验考察了不同固相萃取柱对维生素 B12 含量测定结果的影响. 实验结果表明, 采用 HLB(hydrophile-lipophile balance number) 固相萃取柱进行富集与净化, 维生素 B12 在0.5100.0 µg/L 浓度范围内与其响应值呈良好的线性关系, 检出限为 1.0 µg/kg,

3、说明该方法 具有分析速度快、灵敏度高、重复性好的优点, 适用于对营养强化食品中维生素B12 含量的测定. 关键词 : 维生素 B12 ; 超高效液相色谱-串联质谱; 营养强化食品中图分类号 : TS 207.3文献标志码 : A文章编号 : 1007-2861(2014)01-0114-06Determination of VitaminB12in Fortified Foods byUltra High Performance Liquid Chromatography-TandemMass SpectrometryMA Ying-qing1 , WANG Xia1 , ZHANG Xiao

4、-gang1 , LUO Li-qiang2(1. Shanghai Deno Products Testing Service Co., Ltd., Shanghai 200436, China;2. College of Sciences, Shanghai University, Shanghai 200444, China)Abstract: A simple, fast and accurate method for determination of vitamin B12 in fortifiedfoods is developed using ultra high perform

5、ance liquid chromatography-tandem mass spec- trometry (UPLC-MS/MS). The sample is concentrated by solid phase extraction (SPE) column. The linear range of the method is from 0.5 to 100.0 µg/L with a correlation co- efficient of 0.999 9. The detection limit is 1.0 µg/kg. The proposed method

6、 exhibits high sensitivity and good reproducibility for determining vitamin B12 .Key words: vitamin B12 ; ultra high performance liquid chromatography-tandem quadrupolemass spectrometry (UPLC-MS/MS); fortified food维生素 B12 , 又称钴胺素, 是一种含有 3 价钴的多环系化合物, 4 个还原的吡咯环连在一起成为 1 个咕啉大环(与卟啉相似). 维生素 B12 是一类含有钴的咕啉类

7、化合物的总称, 主要存在于动物性食品中1-2 , 是一种深红色针状晶体, 结构稳定, 在中性溶液中耐热, 但酸、碱、光、氧收稿日期: 2013-07-05基金项目: 国家自然科学基金资助项目(61171033)通信作者: 马颖清(1984), 女, 助理工程师, 研究方向为食品检测. E-mail: myq 0437163 115第 1 期马颖清, 等: 超高效液相色谱-串联质谱测定营养强化食品中维生素 B12 的含量化剂和还原剂均会对其结构造成破坏. 维生素 B12 是维持人体正常造血功能、促进机体生长、保持神经系统功能的必需维生素, 对人体健康具有重要作用3 . 人体所需的维生素 B12

8、的量很少, 从医学角度推荐的日补充量为 2.4 µg, 怀孕和哺乳期妇女的日需要量为 2.6 µg, 婴儿为0.4 µg4 . 补充过量可能会引起过敏反应, 甚至会导致过敏性休克; 摄取不足则可能会引起恶性贫血、骨髓变性、舌炎、神经系统症状、四肢僵硬、易受刺激、困倦、精神不振等. 人体内的 维生素 B12 来源于动物性食物, 如肝、肾、肉类、鱼、贝类动物、禽蛋和乳类等, 植物类食物中 不含维生素 B12 . 由于素食主义者日益增多, 为补充人体所需要的维生素 B12 , 有些商家推出 了营养强化食品, 在其中人为添加了来源于动物性食品中的营养物质维生素 B12 .

9、目前, 用于测定维生素 B12 含量的方法主要有微生物法5 、光谱法6-7 、电化学方法8-11 和 高效液相色谱法12-17 , 其中微生物法操作比较繁琐, 费时费力且不够精确; 光谱法稳定性 较差; 电化学方法灵敏度较低; 现有的高效液相色谱法, 仅适用于测定维生素 B12 含量较高 的预混料, 且测定时间较长. 为了快速、精确地测定营养强化食品如强化大米中维生素 B12 的含量, 本研究利用固相萃取 (solid phase extraction, SPE) 柱对样品进行浓缩与净化, 采 用超高效液相色谱-串联质谱 (ultra high performance liquid chrom

10、atography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS) 法对维生素 B12 的含量进行测定. 本方法中的 SPE 柱价格较 低, 采用 UPLC-MS/MS 方法检测时间较短、简单快捷, 测定结果准确、重现性好.1实验部分1.1 试剂和材料乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯, 无水乙酸钠为分析纯, 购自国药集团; 实验用水为去离子水, 本实验室自制.维生素 B12 标准品(纯度为 98%)购自德国 Dr. Ehrenstorfer 公司; C18 和 HLB(hydrophile- lipophile balance number) 固相萃取柱 (均为 500

11、mg, 6 mL)购自 Waters 公司.1.2 仪器设备超 高 效 液 相 色 谱-串 联 质 谱 联 用 仪(ACQUITY UPLC/Xevo TQ 质 谱 分 析 系 统), 购 自 Waters 公司; 分析天平购自 Mettler 公司; 高速冷冻离心机购自 Thermo Fisher 公司; 漩涡振 荡器购自 Talboys 公司; DSY- 氮吹仪购自北京东方精华苑科技; Millipore 超纯水 系统购自美国 Millipore 公司.1.3 标准溶液配制储 备 液 的 配 制: 准 确 称 取 适 量 的 标 准 品 置 于 容 量 瓶 中, 用 50% 甲 醇 水 溶

12、 液 配 制 成0.1 mg/mL 的标准储备溶液, 于 4 C 冰箱中保存.标准工作液的配制: 准确量取适量储备液, 以乙腈-水(体积比为 19)为溶剂逐级稀释, 得 到一系列标准工作液.1.4 样品制备准确称取 2 g(精确至 0.000 1 g)营养强化大米样品, 置于 50 mL 烧杯中, 加适量温水溶 解、搅拌. 转移至 50 mL 容量瓶中, 加入 25 mL 0.1 mol/L 的乙酸钠溶液(pH=4.5), 于 40 C 水浴中超声 30 min. 取出冷却至室温, 加水定容至刻度, 摇匀. 将样品转移至 50 mL 离心管 中, 5 000 r/min 离心 5 min. 准

13、确移取 15 mL 上清液作为样品提取液, 通过 HLB 固相萃取小 柱(HLB 固相萃取小柱预先用 5 mL 甲醇加 5 mL 水活化), 待样品溶液完全流出后, 加 5 mL5% 甲醇水溶液淋洗固相萃取柱. 弃去流出液, 再用 5 mL 甲醇洗脱小柱, 收集洗脱液, 于 50 C氮气吹干. 最后, 用 5 mL 乙腈-水(体积比为 19) 溶液溶解, 过 0.22 µm 有机相滤膜至样品瓶（自然科学版）116第 20 卷中, 待分析.1.5 色谱条件和质谱条件色谱柱为 Waters BEH C18(100.0 mm×2.1 mm× 1.7 mm); 流动相 A

14、 为 0.1% 甲酸水溶液, 流动相 B 为乙腈, 二者的梯度洗脱条件如表 1 所示; 流速为 0.3 mL/min, 进样体积为 5 µL,柱温为 40 C.表 1 流动相梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phases时间/min流动相 A/%流动相 B/%01.003.003.904.005.00909010109090101090901010离 子 源 为 电 喷 雾 离 子 源,扫 描 方 式 为 正 离 子 模 式,检 测 方 式 为 多 反 应 监 测(multiplereaction monitori

15、ng, MRM); 电 喷 雾 电 压 为 1.0 kV, 离 子 源 温 度 为 150 C, 脱 溶 剂 流 量 为800 L/h. 定性和定量离子对、对应的锥孔电压以及碰撞能量如表 2 所示.表 2测定维生素 B12 的质谱参数Table 2Mass spectrometry parameters for detecting vitamin B12定性离子对 m/z定量离子对 m/z锥孔电压/V碰撞能量/eV保留时间/min678.8/146.9678.8/359.1678.8/457.0678.8/146.9265030362.422结果与讨论2.1 提取液的选择维生素 B12 易溶于

16、水、甲醇和乙醇, 水溶液呈中性.已有研究发现, 维生素 B12 在 pH 值为 4.55.0 的弱酸条件下最稳定, 在强酸(pH<2.0)或碱性溶液中易分解, 遇强光或紫外线易被破坏, 遇热会受到一定程度的破坏15 . 本研究分别选择水、0.1 mol/L 乙酸钠溶液(pH=4.5)和甲醇作为提取液进行实验. 实验结果表明, 以 0.1 mol/L 乙酸钠溶液(pH=4.5)作为提取液时,回收率较高, 且重现性好. 因此, 本实验选择 0.1 mol/L 乙酸钠溶液(pH=4.5)作为提取液.2.2 固相萃取柱的选择维生素 B12 为水溶性维生素, 具有弱极性, 且大米中维生素 B12

17、的含量较低, 基质干扰较多, 无法直接进行检测. 本实验先采用固相萃取法对样品进行浓缩, 选用 Waters C18(500 mg,6 mL) 和 Waters HLB (500 mg, 6 mL) 固相萃取柱对样品进行除杂与富集. 结果发现, 选择 C18 固相萃取柱进行浓缩净化的干扰较大, 回收率低; 而 HLB 固相萃取柱具有较高的吸附容 量, 回收率高. 原因如下: C18 和 HLB 作为两种常用的固相萃取柱, 二者的保留机理均为反相, 但 HLB 固相萃取柱的吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合而成的大孔共聚物, 通过一个“特殊的极性捕获基团”来

18、增加极性物质的保留量,117第 1 期马颖清, 等: 超高效液相色谱-串联质谱测定营养强化食品中维生素 B12 的含量具有良好的水浸润性. 因此与硅胶相比, HLB 固相萃取柱吸附剂的表面积增大了 23 倍, 容量因子大大提高, 且 30 mg HLB 的吸附容量相当于 100 mg C18. 因此, 本实验选择 HLB 固相萃取柱(500 mg, 6 mL)对样品进行净化与浓缩.2.3 线性关系和检出限准确移取适量维生素 B12 储备液, 用乙腈-水(体积比为 19)稀释成一系列的标准工作液,浓度分别为 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 50.0, 100.0 µg/L.

19、以标准工作液中被测组分峰面积为纵坐标, 浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 得到回归方程为 Y =142.995X 8.824 19, 相关系数 r 为 0.999 9. 当维生素 B12 的添加浓度为 1.0 µg/kg 时, 测得的质谱峰信噪比大于 10, 说明本方法的定量检 出限为 1.0 µg/kg. 图 1 为维生素 B12 的标准曲线, 其中 Conc 为浓度(µg/L), Residual 为离散程度, Response 为响应程度.图 1维生素 B12 的标准曲线Fig. 1Standard curves of vitamin B122.4 准确度和精

20、密度本实验选择营养强化大米固体颗粒作为实际样品进行测定, 平行测定 11 次, 相对标准偏差为 3.6%. 维生素 B12 标准品的质谱图如图 2 所示, 其中纵坐标表示响应强度, 横坐标表示保 留时间(min). 可以看出, 维生素 B12 在 2.42 min 处出峰, 峰形尖锐. 与高效液相色谱相比, 出 峰时间较早, 缩短了检测分析时间, 响应灵敏.图 2维生素 B12 标准品的质谱图Fig. 2Mass spectrum of vitamin B12 standards（自然科学版）118第 20 卷同样地, 本研究选择食用大米作为空白样品进行添加回收实验, 按照上述实验方法进行处理

21、及测定. 加标样品的质谱图如图 3 所示, 其中纵坐标为响应强度, 横坐标为保留时间(min),维生素 B12 的浓度为1.0 µg/kg, 加标回收率和精密度测定结果如表 3 所示. 结果表明, 本方法 在食用大米 10.0100.0 µg/kg 浓度添加范围内的回收率在 80%120% 之间, 说明采用本方法 测定维生素 B12 的含量具有可行性.图 3 加标样品的质谱图Fig. 3 Mass spectrum of spiked sample表 3维生素 B12 加标回收率及精密度测定结果Table 3Results of recoveries and precisi

22、ons of vitamin B121测定值/(µg·kg )回收率/%添加浓度/(µg·kg1 )平均回收率/%变异系数/%12312310501008.07548.130101.6008.96546.57098.45011.7349.0299.0480.7596.26101.6089.6593.1498.45117.3098.0499.0495.995.899.72.01.31.7结 束 语3本研究采用弱酸性溶液提取样品, 通过固相萃取法对样品进行净化与富集, 运用 UPLC-MS/MS 法对营养强化食品中的维生素 B12 含量进行测定. 与已有方法

23、相比, 本方法准确度高、干扰少, 能够排除液相色谱方法中的杂峰干扰, 具有灵敏、快速、准确等优点.参考文献:1 周芳梅, 蔡双福, 文灿, 等. 固相萃取-高效液相色谱法测定饮料中维生素 B12 J. 现代食品科技,2010, 26(7): 759-762.119第 1 期马颖清, 等: 超高效液相色谱-串联质谱测定营养强化食品中维生素 B12 的含量2 李红艳, 王瑾, 邵亮亮, 等. 固相萃取-高效液相色谱法测定功能性饮料中微量维生素 B12 J. 浙江农业科学, 2012(3): 384-386.3 Guggisberg D, Risse M C, Hadorn R. Determina

24、tion of vitamin B12 in meat products byRP-HPLC after enrichment and purification on an immunoaffinity column J. Meat Science,2012, 90(2): 279-283.4 鲁杰, 杨大进, 王竹天. 固相萃取-高效液相色谱法测定保健食品中维生素 B12 的研究 J. 中国食品卫生杂志, 2004, 16(4): 324-328.5 中华人民共和国卫生部. GB 5413.142010 婴幼儿食品和乳品中维生素 B12 的测定 S. 北京: 中华人民共和国卫生部, 2010

25、.6 李姝. 紫外吸光光度法测定维生素 B12 J. 理化检验: 化学分册, 2005(1): 53-54.7 Zhou Y K, Li H, Liu Y, et al. Chemiluminescence determination of vitamin B12 by a flow- injection method J. Analytica Chimica Acta, 1991, 243: 127-130.8 向伟, 李将渊, 马曾燕. 多壁碳纳米管修饰金电极测定维生素 B12 J. 化学研究与应用, 2007, 19(6):710-716.9 刘永明, 李桂芝. 维生素 B12 在玻碳电极上的伏安行为及测定 J. 分析化学, 2004, 32(9): 1182-1184. 10 Kuralay F, Vural T, Bayram C, et al. Carbon nanotube-chitosan modified