实验室污染防治实用教案

1、PCR污染污染(wrn)的监测的监测 PCR强大扩增能力+检测(jin c)的敏感性经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题NTC (No Template Control): 必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对照反应，这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加。 第1页/共15页第一页，共15页。常见常见(chn jin)的的PCR contamination 常规(chnggu)PCR 荧光定量PCRNTC432176598NTC第2页/共15页第二页，共15页。引起引起PCR污染污染(w

2、rn)的原因的原因模板间交叉( jioch)污染容器被污染模板放置时, 由于密封不严溢于容器外容器外粘有模板而造成相互间交叉( jioch)污染模板吸取过程中, 因气溶胶（aerosol）或其他原因引起移液器污染，从而导致交叉( jioch)污染第3页/共15页第三页，共15页。引起引起(ynq)PCR污染的原因污染的原因 PCR试剂污染 PCR 试剂配制过程中, 移液器、容器、水等原因造成试剂被PCR 核酸(h sun)模板污染。第4页/共15页第四页，共15页。引起引起PCR污染污染(wrn)的原因的原因 PCR产物污染-最主要最常见 PCR 产物拷贝量大，极微量的PCR产物污染, 就可形

3、成(xngchng)假阳性。 移液器吸取PCR产物进行电泳检测，同一支移液器去准备PCR mix PCR产物的气溶胶污染： 一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝气溶胶（aerosol）：悬浮于气体介质中粒径一般为 0.001m1000m的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶, 在操作时比较剧烈地摇动反应(fnyng)管, 开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可形成气溶胶第5页/共15页第五页，共15页。引起引起PCR污染污染(wrn)的原因的原因 实验室中克隆质粒的污染 克隆质粒浓度高, 另外在纯化(chn hu)过程中需用较多的用具及试剂, 其污染可能性也很大第6

4、页/共15页第六页，共15页。防止防止(fngzh)PCR污染污染首要原则永远要设置NTC对照 如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的后果：一大段时间的数据不可(bk)信准备PCR的移液器要专用 千万不能用吸取PCR产物/克隆质粒的移液器去准备PCR 体系第7页/共15页第七页，共15页。防止防止(fngzh)PCR污染污染空间： 合理分隔实验区域:将样品的处理、配制(pizh)PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。 理想状态： 各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区域用紫外线消毒，破坏残留的DNA或

5、RNA。第8页/共15页第八页，共15页。防止防止(fngzh)PCR污染污染操作一旦进入吸加PCR试剂(shj)的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并应勤于更换。准备专供自己使用的PCR试剂(shj)，分装为小份。不要与样品存放在一起。选择质量好的Eppendorf管-密封性好且开管不需要太大力气打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。实验结束后及时清理台面第9页/共15页第九页，共15页。防止(fngzh)PCR污染移液器操作(cozu)由于操作(cozu)时不慎将模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样时要十分小心。1）准备P

6、CR的移液器专用2）吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成喷雾，以免交叉污染或产生气溶胶污染。3）最好在加完所有其他反应成分后才吸加模板。4）推荐在准备PCR过程中使用滤芯枪头第10页/共15页第十页，共15页。 选用含UNG（尿嘧啶DNA糖基酶 Uracil-N-Glycosylase)的试剂，有助于防止PCR产物引起的污染。 UNG：50摄氏度，2分钟，作用于含有dU的DNA双链或单链 然后开始PCR反应(fnyng)的预变性步骤，同时UNG失活防止(fngzh)PCR污染对于(duy)不含dU的PCR产物无效第11页/共15页第十一页，共15页。出现出现(chxin)污染后

7、解决办法污染后解决办法更换试剂 更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等 1）实验台面、超净工作台用现配的3%双氧水或10%次氯酸钠溶液擦拭清洁。 2）或者用10%漂白粉溶液擦拭 3) 紫外光照射，照射距离应不超过90 cm，照射时间最好过夜。实验过程中更加小心，采用(ciyng)前面提到的各种防止污染的办法第12页/共15页第十二页，共15页。参考文献参考文献 Kwok S ,Higuchi R. Avoiding false positives with PCRJ . Nature ,1989 ,339 (6221) :237 - 238. Mifflin T.E. Setting Up a PCR Laboratory. CSH Protocols; 2007; doi:10.1101/pdb.top14 第13页/共15页第十三页，共