微生物限度方法学验证

1、微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法 （中国药典 2015 年版四部 1105） ；控制菌检查法（中国药典 2015年版四部 1106） ；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部 1107） ；抑菌效力检查法（中国药典2015 年版四部 1121）检查。二、菌种、培养基及稀释液表 1 菌种菌种名称菌种代数菌种状态厂家大肠埃希菌 cmcc(b)44102 3 正常浙江省食品药品检验研究院金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003 3 正常枯草芽孢杆菌cmcc(b)63501 3 正常白色念珠菌 cmcc(f)98001 3 正常黑曲霉 cmcc(f)98003 3 正常乙

2、型副伤寒沙门菌cmcc(b)50094 3 正常表 2 培养基培养基名称批号厂家营养肉汤培养基150222 北京三药科技开发公司改良马丁培养基150134 北京三药科技开发公司改良马丁琼脂培养基150215 北京三药科技开发公司营养琼脂培养基150317 北京三药科技开发公司玫瑰红钠琼脂培养基150323 北京三药科技开发公司胆盐乳糖培养基150127 北京三药科技开发公司胆盐硫乳琼脂培养基150214 北京三药科技开发公司四硫磺酸钠亮绿培养基150416 北京三药科技开发公司mug 培养基150122 北京三药科技开发公司曙红亚甲蓝琼脂培养基150137 北京三药科技开发公司三糖铁琼脂培养基

3、150207 北京三药科技开发公司表 3 对照用培养基对照培养基名称批号厂家营养肉汤对照培养基135004-201103 中国食品药品检定研究院营养琼脂对照培养基135003-201002 中国食品药品检定研究院玫瑰红钠琼脂对照培养基135005-201002 中国食品药品检定研究院胆盐乳糖对照培养基135006-201404 中国食品药品检定研究院胆盐硫乳琼脂对照培养基135010-201102 中国食品药品检定研究院四硫磺酸钠亮绿对照培养基135020-201101 中国食品药品检定研究院mug 对照培养基135012-201001 中国食品药品检定研究院曙红亚甲蓝琼脂对照培养基13500

4、9-201102 中国食品药品检定研究院三糖铁琼脂对照培养基表 4 试剂试剂名称批号级别磷酸二氢钾130826 分析纯氢氧化钠20150117 分析纯氯化钠20140714 分析纯聚山梨酯 80 20141011 化学纯95% 乙醇15070722 药用级二甲氨基苯甲醛20140402 分析纯盐酸20140533 分析纯稀释液：（1）ph6.8缓冲液取0.2mol/l 磷酸二氢钾溶液250ml, 加0.2mol/l 氢氧化钠溶液118ml, 用水稀释至1000ml，摇匀，既得。（2）0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠 9.0g ，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。（3）0.05 （ml/

5、ml ）聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯 80 0.5ml ，用 0.9 无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml， 滤过，分装，灭菌，备用。（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛1.0g ，加入 95% 乙醇 95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml 徐徐滴入。三、菌液的制备1 细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养 24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48 小时。上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为 50100cfu 的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马

6、丁琼脂斜面培养基上，培养7 天，加入 5ml 含 0.05（ml/ml）聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液 ,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数 50100cfu 的孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置， 应在 2 小时内使用， 若保存在28可在 24 小时内使用。2 控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养 24 小时。用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为 10100cfu 的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2 小时内使用，若保存在28可在

7、24小时内使用。四、验证内容1、计数方法验证将制备好的菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液以每10倍体积分别稀释成一系列浓度菌悬液，利用血球计数板计数， 确定具体菌悬液浓度， 取接近于 10cfu-100cfu 的稀释浓度，选取各项试验项下的规定浓度进行实验。稀释及观察均应在阳性室内完成。经过验证当原液稀释至10-6时，菌液浓度接近 100cfu/ml。2、适用性检查2.1 细菌、霉菌、酵母菌取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml(内含菌约 50100cfu)，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，混匀，凝固， 置 3035培养 48 小时， 计数；

8、取白色念珠菌、黑曲霉 1ml(内含菌约 50100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，混匀，凝固，置2328培养 72 小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照。其大小、形态应与对照培养基一致，且数量应不小于对照培养基的70%。细菌、霉菌及酵母菌培养基适用性检查培养基名称菌种名称测试培养基（cfu）对照培养基（cfu）回收率(%) 大小形态标准结论碟 1 碟 2 平均碟 1 碟 2 平均营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌87 83 85 95 99 97 87.6 一致大小形态一致且回收率 7

9、0%符合规定金黄色葡萄球菌88 82 85 94 98 96 88.5 一致大 小 形 态一 致 且 回收率 70%符合规定大肠埃希菌83 86 84.5 95 95 95 88.9 一致大 小 形 态一 致 且 回收率 70%符合规定玫瑰红钠培养基枯草芽孢杆菌84 87 85.5 99 94 96.5 88.6 一致大 小 形 态一 致 且 回收率 70%符合规定金黄色葡萄球菌90 86 88 97 101 99 88.9 一致大 小 形 态一 致 且 回收率 70%符合规定大肠埃希菌88 83 85.5 92 99 95.5 89.5 一致大 小 形 态一 致 且 回收率 70%符合规定培

10、养基中细菌、霉菌、酵母菌的生长情况良好，回收率在80%，且与对照培养基状态一致，证明此批次培养基可以准确的检测出相应微生物情况。2.2 控制菌2.2.1促生长能力取大肠埃希菌菌悬液 0.1ml （内含菌约 10100cfu） ，分别置于胆盐乳糖培养基、 mug培养基、营养肉汤培养基中； 取乙型副伤寒沙门菌 0.1ml（内含菌约 10100cfu） ，分别接种于营养肉汤培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基，取乙型副伤寒沙门菌 0.1ml （内含菌约 10100cfu）涂布于胆盐硫乳琼脂培养基、 曙红亚甲蓝琼脂培养基中； 于 35培养 18 小时，同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对

11、照，每个培养基平行制备 2 个平皿。胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基、 mug 培养基与对照管比较，被检培养基管试验菌应生长良好；胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。2.2.2抑制能力取金黄色葡萄球菌 100 cfu左右，注入无菌平皿中，立即倾注胆盐乳糖培养基、 四硫磺酸钠亮绿培养基，每个培养基平行制备2 个平皿，混匀，凝固，置 35培养 18 小时，应不得有菌生长。2.2.3指示能力取乙型副伤寒沙门菌 10100cfu，接种于三糖铁琼脂培养基中，每个培养基平行制备2 个平皿，混匀，凝固，置 3035培养 18 小时；胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲

12、蓝琼脂培养基指示能力见 2.2.1中乙型副伤寒沙门菌测试结果，mug 培养基指示能力见 2.2.1中大肠埃希菌测试结果。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反映情况等应与对照培养基一致。控制菌培养基适用性检查培养基名称促生长性（与对照比较）抑制性（与对照比较）金黄色平葡萄球菌指示性（与对照比较）乙型副伤寒沙门菌结论菌种名称形态大小形态大小指示反应胆盐乳糖培养基大肠埃希菌一致一致无生长- - - 符合规定mug 培养基大肠埃希菌一致一致- 一致一致一致符 合规定营养肉汤培养基大肠埃希菌一致一致- - - - 符 合规定乙型副伤寒沙门菌一致一致- - - - 符

13、合规定四硫磺酸钠亮绿培养基乙型副伤寒沙门菌一致一致无生长- - - 符 合规定胆盐硫乳琼脂培养基乙型副伤寒沙门菌一致一致- 一致一致一致符 合规定曙红亚甲蓝琼脂培养基乙型副伤寒沙门菌一致一致- 一致一致一致符 合规定三糖铁琼脂培养基- - - - 一致一致一致符 合规定培养基的促生长性及指示性菌落生长状态一致，抑制性均无菌落生长，说明培养基适用性良好。3、抑菌性：取连续生产的三批样品进行测定3.1 细菌 、霉菌、酵母菌3.1.1供试液的制备：称取本品10g，加 ph6.8 缓冲液 100ml，混匀，制成 1：10 的供试液。3.1.2 试验组：取大肠埃希菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液和枯草芽孢

14、杆菌菌悬液各1ml，分别加上述供试液1ml，注入平皿中， 立即倾注 1520ml 温度不超过 45溶化的营养琼脂培养基培养，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌数。31.3 菌液组：取上述各试验菌液1ml，加入相应的培养基培养，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。3.1.4供试品对照组：取供试液1ml，分别注入 1520ml 温度不超过 45溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基培养，每个培养基平行制备2 个平皿。3.1.5回收率标准以供试品对照组为样品空白(c0)、以菌液组为对照 (t)、以试验组为测试品 (c)计：(c-c0)/t70% 细菌、霉菌及酵母菌抑菌性检测

15、结果统计批号培养基名称菌种培养时间（h）菌液组菌数cfu 试验组菌数cfu 供试品对照组菌数回收率 % 数值平均数值平均数值平均150804 营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌72 84 86 90 92.5 8 10 95.9 72 88 95 金黄色葡萄球菌72 86 84 93 91.5 97.0 72 82 90 12 大肠埃希菌72 84 85.5 91 92 95.9 72 87 93 玫瑰红钠培养基枯草芽孢杆菌120 86 86.5 84 85 0 0 98.3 12087 86 金黄色葡萄球菌12087 87.5 85 86 98.3 12088 87 0 大肠埃希菌12087 85.

16、5 83 83 97.1 12084 83 150805 营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌72 88 85 95 92.5 6 5 97.1 72 86 90 金黄色葡萄球菌72 85 84.5 95 93.5 95.5 72 84 92 4 大肠埃希菌72 81 84.5 89 91.5 97.7 72 87 94 玫瑰红钠培养基枯草芽孢杆菌120 83 85 87 87.5 0 0 97.1 12087 88 金黄色葡萄球菌12086 84 88 86.5 97.1 12082 85 0 大肠埃希菌12088 84 86 88 95.5 12080 90 150806 营养琼脂培养基枯草芽孢杆菌

17、72 87 85.5 94 95.5 6 6 95.5 72 84 97 金黄色葡萄球菌72 83 86 96 96 95.6 72 89 96 6 大肠埃希菌72 85 85.5 95 96 95.0 72 86 97 玫瑰红钠培养基枯草芽孢杆菌120 84 84 85 87 0 0 96.6 12084 89 金黄色葡萄球菌12085 85.5 90 89 96.1 12086 88 0 大肠埃希菌12082 83.5 89 87 96.0 12085 85 通过连续三批次不同种菌类的加样，回收率均在90%以上，说明本产品对于细菌、霉菌及酵母菌不具备抑菌性。3.2 控制菌3.2.1大肠埃希

18、菌取 10 ml 供试液（制备方法同3.1.1）及大肠埃希菌菌悬液 1ml(10100cfu)加入胆盐乳糖培养基 100ml，于 35培养 24 小时。取上述培养物 0.2ml，接种至含 5ml mug 培养基的试管内，培养，于 5 小时、24小时在 366nm紫外灯下观察，同时用未接种的 mug 培养基作本底对照。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液。紫外灯照射时管内培养物呈现荧光，为 mug 阳性；不呈现荧光，为 mug 阴性；加入靛基质试液时液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。3.2.2沙门氏菌取 10 ml 供试液（制备方法同3.1.1）及乙型副伤寒沙门菌 1ml(10100cfu)，直接接种至 200ml 的营养肉汤培 养基中，混匀，于 35培养培养 24 小时，取上述培养物 1ml，接种于 10ml 四硫磺酸钠亮绿培养基中， 35培养 24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂培养基和曙红亚甲蓝琼脂培养基的平板上， 35