4-1-化学发光免疫分析技术-课件PPT

1、2021/8/261化学发光免疫分析化学发光免疫分析2021/8/262Contents化学发光免疫的基本概念化学发光免疫的基本概念 化学发光剂和标记技术化学发光剂和标记技术化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型123 电化学发光免疫电化学发光免疫42021/8/263化学发光免疫的基本概念化学发光免疫的基本概念 12021/8/2641.1 1.1 化学发光的基本原理化学发光的基本原理是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的

2、过程。并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: :光照发光、生物发光、光照发光、生物发光、化学发光化学发光等。等。生物发光的本质是化学发光2021/8/265 某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生的化学能化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光化学发光(Chemiluminescence，CL) 。 1.1 1.1 化学发光的基本原理化学发光的基本原理2021/8/266化学发光分析 根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或反应的发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法

3、，称为化学发光分析。2021/8/267化学发光分析优点 化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，就避免了荧光分析中激发光杂散光的影响有很高的灵敏度， 并且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。2021/8/268化学发光分析缺点 虽然化学发光具备很高的特异性和很小的干扰，但化学分析本身的不特异性，制约了整个方法的使用。2021/8/269化学发光免疫分析Chemiluminescence immunoassay (CLIA)化学发光化学发光免疫学免疫学 特异性强特异性强 敏感性高敏感性高 简便、快速简便、快速 重复性好重复性好2021/8/26101

4、.2 1.2 化学发光的种类化学发光的种类v直接化学发光直接化学发光一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。光。反应过程可简单地描述如下：A + B C* + DC* C + h 12021/8/26111.2 1.2 化学发光的种类化学发光的种类v间接化学反应发光间接化学反应发光 若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子F上，使上，使F

5、分子激发到电子激发态，分子激发到电子激发态，F分子从激发分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下： A + B C* + D C* + F F* + C F* F + h 22021/8/2612化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（激发效率（CE）和激发态分子的发射效率）和激发态分子的发射效率（EM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的）。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个

6、发光反应都具有其特征性的化学所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。发光光谱和不同的化学发光效率。1.3 化学发光的效率化学发光的效率2021/8/26132021/8/2614 化学发光剂和标记技术化学发光剂和标记技术22021/8/26152.1 2.1 化学发光剂概念化学发光剂概念在化学发光反应中参与能量转移并最终在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，以发射光子的形式释放能量的化合物，称为称为化学发光剂化学发光剂或或发光底物。发光底物。2021/8/2616 化学发光剂选择条件：化学发光剂选择条件：发光的量子产率高；发光的量子

7、产率高；物理物理- -化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； 其化学发光常是氧化反应的结果；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。2021/8/2617直接化学发光剂直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。产生发光的特有基团，可

8、直接标记抗原或抗体。 2.2 2.2 化学发光剂种类化学发光剂种类直接化学发光剂，间接化学发光剂直接化学发光剂，间接化学发光剂2021/8/2618 A. . 吖啶酯吖啶酯 在碱性条件下被在碱性条件下被H2O2氧化时氧化时,发出发出波长为波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激的光，具有很高的发光效率，其激发态产物发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。 2021/8/2619 代表性物质：光泽精代表性物质：光泽精 (lucigenin)NCH3NCH3+.2NO3-OxidationOH -NOCH3*NMA+LIGHTLucigeninN-

9、METHYLACRIDONE (NMA)氧化剂：H2O2还原剂：乳酸 尿酸 抗坏血酸催化剂：过渡金属离子、酶抑制剂：酚类物质对此反应有抑制作用间接测定：能够生成H2O2的基质及相应的酶max = 445 nm量子产率高，易于标记，量子产率高，易于标记，是发展化学发光免疫分析是发展化学发光免疫分析和和DNA发光探针的重要标发光探针的重要标记物记物2021/8/2620B.B.三联吡啶钌三联吡啶钌 三联吡啶钌三联吡啶钌 RU(bpy)32+是电化学是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。可同时失去一个电子而

10、发生氧化反应。 三联吡啶钌三联吡啶钌2021/8/2621酶促反应发光剂：酶促反应发光剂：利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。 A鲁米诺及其衍生物鲁米诺及其衍生物 BAMPPD间接化学发光剂间接化学发光剂2021/8/2622A.A.鲁米诺及其衍生物鲁米诺及其衍生物 鲁米诺发光原理鲁米诺发光原理2021/8/2623BAMPPD3-(23-(2- -螺旋金刚烷螺旋金刚烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3-4-(3“- -磷酰氧基磷酰氧基) )苯

11、苯-1,2-1,2-二氧杂环丁烷二氧杂环丁烷2021/8/2624A. A. 碳二亚胺（碳二亚胺（EDCEDC）缩合法）缩合法 2.3 2.3 发光剂的标记发光剂的标记2021/8/2625B. B. 过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法 2021/8/2626C C重氮盐偶联法重氮盐偶联法 2021/8/2627D. N-D. N-羟基琥珀酰亚胺活化法羟基琥珀酰亚胺活化法 2021/8/2628 1 1发光剂的选择发光剂的选择 2 2被标记蛋白质的性质被标记蛋白质的性质 3 3标记方法的选择标记方法的选择 4 4原料比原料比 5 5标记率标记率 6 6温度温度 2.4 2.4 影响发光剂的标记的因素

12、影响发光剂的标记的因素2021/8/2629化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型32021/8/2630p用化学发光剂（吖啶酯或鲁米诺类）直接标记抗体用化学发光剂（吖啶酯或鲁米诺类）直接标记抗体(抗原抗原)，与待测标本中相应的抗原，与待测标本中相应的抗原(抗体抗体)发生免疫反应发生免疫反应后，形成固相包被抗体后，形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-化学发光剂标记抗体化学发光剂标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和）和NaOH使成使成碱性环境，化学发光剂在不需要催化剂的情况下分解、碱性环境，化学发光剂在不需要催化剂的情况下分解、发光发光 。p由集光器

13、和光电倍增管接收、记录单位时间内所产由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。3.1 3.1 直接化学发光免疫分析直接化学发光免疫分析2021/8/2631发光发光Y YY磁微粒磁微粒被测抗原被测抗原+抗体抗体+带吖啶酯标带吖啶酯标记物抗体记物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后冲洗后（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化学发光的机理（夹心法）直接化学发光的机理（夹心法）2021/8/2632 化学发光酶免疫

14、分析（化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原体，在与待测标本中相应的抗原(抗体抗体)发生免疫反应后，形成固发生免疫反应后，形成固相包被抗体相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶标记抗体复合物，酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物经洗涤后，加入底物(发光剂发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光，酶催化和分解底物发光，由

15、光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。3.2 3.2 化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析2021/8/2633该分析系统采用辣根过氧化物酶（该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体）标记抗体(或抗原或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、）标记

16、抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。和化学发光增强剂使产生化学发光。3.2.1 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析2021/8/2634辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 3.2.1 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析2021/8/2635该分析系统以碱性磷酸酶该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体标记抗体(或抗原或抗原)，在与，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体形

17、成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶标记抗体复合物，酶标记抗体复合物，这时加入这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱脱去磷酸根基团而发光。去磷酸根基团而发光。 3.2.2 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析2021/8/2636碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 3.2.2 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析2021/8/2637分配样品分配样品, ,磁颗粒磁颗粒和试剂和试剂孵育，使反孵育，使反应物结合应物结合在磁场中清在磁场中清洗去除未结洗去除未结合物质合物质加入

18、底物加入底物产生信号产生信号孵育孵育, ,促使促使信号的产生信号的产生信号信号检测检测2021/8/2638 电化学发光免疫电化学发光免疫4Flow cellFeOxidizedReduced2021/8/2639Electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA20世纪80年代出现，90年代用于临床检测。ECLIA电化学电化学免疫学免疫学化学发光化学发光发光特点：发光特点：联吡啶钌（标记物+三丙胺自由基（催化）+三角形脉冲电压（激发），0.01ms0.01ms就就可发出稳定的光可发出稳定的光。优点：优点：1. 灵敏度高（联吡啶钌再循环），2.检测步骤简化（

19、游离/结合）3.可实现多元检测 4.可实现自动化2021/8/2640 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析 Electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA原理原理电化学发光、免疫分析检测、生物素电化学发光、免疫分析检测、生物素-抗生素、固相磁抗生素、固相磁珠技术珠技术2021/8/2641电化学发光剂 定义：指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。

20、特点 反应在电极进行 化学发光剂：三联毗啶钌 电子供体为：三丙胺（TPA）NNNNNNRuOONOO2021/8/2642 ECL分析中采用Ru(bpy)32+作为标记物，其活化衍生物是Ru(bpy)32+N羟基琥珀酸胺酯（NHS） ，该衍生物具有水溶性，且高度稳定，保证电化学发光反应的高效和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。三联吡啶钌 Ru(bpy)32+ 特点2021/8/2643 Ru(bpy)32+衍生物与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性； Ru(bpy)32+分子量小，空间位阻小 ，即便小分子的核酸也能标记，使检测的样品种类大大丰富，更重要的是为其检测样品

21、种类的开发前景提供了广阔空间。三联吡啶钌 Ru(bpy)32+ 特点2021/8/26441电化学反应2化学发光3循环+ECLIA ECLIA 原理原理2021/8/2645常用方法类型常用方法类型 固相磁性微球吸附 采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8 m的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大2030倍，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度大大加快； 链霉亲和素-生物素吸附 “链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统，使检测的灵敏度大大提高亲和素糖蛋白；生物素-维生素H2021/8/2646ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成）2021/8/2647ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合）2021/8/264